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Sequencing-Workflow

MPS-Automation: Kein Engpass absehbar

Das Interesse an Verfahren des Massive Parallel Sequencing (MPS) wächst derzeit in immer mehr Bereichen der Grundlagen- und angewandten Forschung. Das Anwendungsspektrum der Hochdurchsatztechnologie deckt – nur acht Jahre nach der Markteinführung des ersten Next-Generation-Sequenzers – bereits die gesamte Palette der Nukleinsäure-basierten -Omics-Analysen ab: Untersuchungen ganzer Genome, Transkriptome oder Methylome zahlreicher, großer wie kleiner, Organismen.

Auch die Kapazität der Sequenzer steigt weiter. Dank der Möglichkeit, viele per Strichcode markierte Bibliotheken in einer Spur zu poolen, kann heute eine Vielzahl an Proben simultan sequenziert werden. Dabei ist es allerdings wichtig, den Sequenzerdurchsatz mit der Leistungsfähigkeit der vorgeschaltetenen Schritte abzustimmen, wie zum Beispiel die Qualitätsprüfung der Proben, die Vorbereitung der Sequenzbibliotheken sowie – nach deren Generierung – die Qualitäts- und Quantitäts-Überprüfung.

Die GeneCore Facility am EMBL in Heidelberg bietet einer beträchtlichen und weiter wachsenden Gemeinde von Wissenschaftlern ihre Kompetenz im Massive Parallel Sequencing, um hochqualitative DNA- und RNA-Sequenzdaten für Forschungsprojekte zu erzeugen. Dabei wächst die Zahl der Proben aus verschiedenen Quellen, aus denen Sequenzbibliotheken für unterschiedliche MPS-Anwendungen generiert werden, stetig. Um der wachsenden Nachfrage gerecht zu werden, war eine umfassende Automation erforderlich. Die automatische Library-Herstellung erfolgt aktuell mit einem Liquid-handling-Roboter, der 96 Bibliotheken in einem Lauf erstellt.

Walk-away Automation

Um den Ablauf weiter zu optimieren, fehlte bislang Ausrüstung, die einen vergleichbaren Durchsatz sowie eine klare Visualisierung in vorangehenden und nachfolgenden Arbeitsschritten gewährleistet. Diese umfassen etwa die Prüfung der Verteilung der DNA-Fragmente nach Fragmentierung der Probe oder die qualitative und quantitive Überprüfung der erstellten Sequenzbibliotheken vor deren Laden in den Sequenzer. Nach Tests verschiedener Systeme am Markt fiel die Entscheidung auf den 12-capillary Fragment Analyzer™ von Advanced Analytical Technologies Inc. (AATI).

Aus unserer Erfahrung mit der Kapillarsequenzierung wussten wir, dass die Kapillarelektrophorese ein robustes und bereits in zahlreichen Anwendungen erprobtes Trennverfahren ist. Tatsächlich erwies sich der Fragment Analyzer™ im Praxistest als einfach handhabbar. Zudem sind die Instandhaltungskosten des Gerätes sowie die Kosten pro Probe bei zugleich hoher Datenqualität gering. Das Gerät ermöglicht damit eine vollautomatisierte, einfache und wirtschaftliche Analyse von DNA- und RNA-Proben, die für das Next-Generation Sequencing bestimmt sind. 

Derzeit nimmt GeneCore unter Leitung von Peer Bork an einer großen Studie teil, in der die Zusammensetzung des humanen gastro-intestinalen Mikrobioms untersucht wird. Im Gegensatz zum mehr oder weniger konstanten Humangenom zeigt das Mikrobiom eine große Veränderlichkeit. Wissenschaftlich wird diskutiert, ob seine Zusammensetzung oder ob Imbalancen zur Vorhersage von Gesundheit und Krankheit genutzt werden können. Bei der Analyse von Tausenden DNA-Proben spielt auch das neue System eine große Rolle für den Arbeitsablauf von der Probe bis zur Sequenz. Mehr als tausend Proben sind derzeit bereits erfolgreich mit ihm verarbeitet worden. 

Autoren

Rajna Hercog, Jelena Pistolic, Paul Collier und Dinko Pavlinic
AG Dr. Vladimir Benes
European Molecular Biology Laboratory
Heidelberg

  

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4/2013

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