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Blitzlicht

DETECTIVE – Suche nach Biomarkern zur Prognose der Langzeittoxizität

Das Forschungsprojekt DETECTIVE ("Ermittlung von Endpunkten und Biomarkern für Langzeittoxizität mit der Hilfe von in vitro-Systemen") hat eine Laufzeit von fünf Jahren und wird zu gleichen Teilen von der Europäischen Kommission und dem Europäischen Kosmetikverband CoLIPa unterstützt.

Prof. Dr. Jürgen Hescheler, Klinikum der Universität zu Köln

Fünfzehn europäische Partner aus der akademischen Forschung, der Industrie, KMU und Interessengruppen haben sich zusammengeschlossen, um Strategien zur Bestimmung der Langzeittoxizität zu entwickeln, die effizienter und zuverlässiger sind als Tierversuche. Langzeittoxizitätstests sind zum Nachweis der Unbedenklichkeit chemischer Substanzen für den Menschen vorgeschrieben, so auch für Kosmetika. Tatsächlich kann die Langzeit- oder wiederholte Anwendung über einen längeren Zeitraum zu einer progressiven Zell-, Gewebe- oder Organschädigung führen. Bisher werden solche Untersuchungen an Tieren durchgeführt, denn es gibt dazu noch keine anerkannten Alternativen.

Im Rahmen des 7. Europäischen Forschungsrahmenprogramms haben die Europäische Kommission und Colipa die integrierte Forschungsstrategie „SEURAT-1“ für Tierersatz­methoden initiiert. Das mit insgesamt 50 Mio. Euro ausgestattete SEURAT-1-Forschungsprogramm hat das Langzeitziel, Methoden zur Unbedenklichkeitsprüung zu entwickeln, die letzlich Tierversuche ersetzen können („Safety Evaluation Ultimately Replacing Animal Testing”). Die erste Phase von SEURAT begann am 1. Januar 2011 und besteht aus sechs, sich ergänzenden Bausteinen. DETECTIVE ist einer dieser Bausteine und zielt auf die Entwicklung von Biomarkern für die Detektion der Langzeittoxizität in humanen Zielzellen ab. Zu diesem Zweck wird eine Test-Pipeline aufgebaut, die auf High-Content-Screening (HCS) and High-Throughput-Screening(HTS)-Technologien basiert. In Kombination mit klassischen funktionellen und „-omics“ Methoden werden humane Biomarker identifiziert und untersucht, die geeignet für die Langzeit-Testung in vitro sind.

Der Koordinator des DETECTIVE-Projekts, Prof. Dr. Jürgen Hescheler von der Universität zu Köln, erwartet wichtige Ergebnisse von dem Projekt. Laut Hescheler wird die multidisziplinäre Zusammenarbeit im DETECTIVE-Konsortium ein detaillierteres, grundlagenbasiertes Verständnis toxikologischer Langzeiteffekte ermöglichen. Dadurch wird die Toxikologie von einer primär deskriptiven zu einer mehr mechanistischen Wissenschaft mit größerer Vorhersagekraft werden, von der am Ende auch der Verbraucher profitiert.

Fokus liegt zunächst auf  Leber-, Herz- und Nierentoxizität

Als einer der Bausteine der SEURAT-1 Forschungsinitiative konzentriert sich DETECTIVE auf ein wesentliches Element, auf dem in vitro-Toxizitätstests basieren – der Entwicklung von robusten sowie zuverlässigen, sensitiven und spezifischen Biomarkern.

Der Schwerpunkt liegt auf einer systematischen Auswertung einer Reihe komplementärer funktioneller und „-omics“ Technologien, einschließlich HCS und HTS, zur Identifizierung und Untersuchung humaner Biomarker in Zellmodellen für die Langzeittoxizität. Dabei gewähren funktionelle Parameter Einblicke in die Wirkung von Schadstoffen auf spezifische Zellfunktionen, „omics“-Techniken dagegen Informationen zur gesamten zellulären Situation auf molekularer Ebene. Erstmalig werden eingehend die Auswirkungen von Mehrfach- oder Langzeitgaben auf die für das Zellverhalten kritische Epigenetik und microRNA (miRNA)-Expression untersucht, um zu prüfen, ob derartige Analysen das Verständnis von toxischen Wirkmechanismen vertiefen können.

Durch die Kombination und anschließende Integration der verschiedenen Technologien können prädiktive Biomarker für die humane Langzeit-Toxizität in vitro entwickelt werden. Basierend auf integrativer statistischer Analyse, systematischer Überprüfung und Korrelation mit in vivo relevanten Daten, werden spezifische, sensitive und prädiktive Biomarker entwickelt.

DETECTIVE konzentriert sich auf hepatoxische, kardiotoxische, und – in geringerem Umfang – auch auf nephrotoxische Effekte, die die drei Zielorgane der Toxizität bei wiederholter Verabreichung repräsentieren. Darüber hinaus wird ein Langzeit-Toxizitätsmodell auf Basis humaner embryonaler Stammzellen (hES) entwickelt. Letztlich werden die erarbeiteten Konzepte auch für andere Organe oder Organsysteme anwendbar sein, die von systemischen Giftstoffen angegriffen werden, zum Beispiel das Nervensystem. Darüber hinaus wird erwartet, dass DETECTIVE generelle humane Toxizitätspathways definieren kann, die für alle Organe relevant sind.

Ziel: Entwicklung von in vitro-Tests  und Surrogatmarkern

Das übergeordnete Ziel von DETECTIVE ist die Entwicklung und Evaluierung von in vitro-Biomarkern und Surrogat-Endpunkten, die für den Menschen relevant sind und die für die Sicherheitsbewertung von chronisch wirkenden Giften genutzt werden können. Konkret werden im DETECTIVE-Projekt Biomarker für Humantoxizität auf der Grundlage humaner in vitro-Systeme entwickelt, und zwar durch:

  • Zusammenarbeit mit den anderen Bausteinen der SEURAT-1 Forschungsinitiative unter Einbeziehung des Stands der Technik und toxikologischen Daten zu bereits bekannten Biomarkern für chronische Organschäden wie Kardiomyopathien, Arrhythmien, Leberzirrhose, Fettleber, Cholestase, Apoptose und anderen relevanten biologischen Prozessen.
  • Bewertung der Eignung und Robustheit der vorhandenen Zellsysteme für den in vitro-Einsatz zur Entwicklung von Biomarkern für Toxizität bei wiederholter Gabe.
  • Entwicklung funktioneller Techniken in humanen in vitro-Modellen, hauptsächlich für Leber-, Herz- und Nierenzellen sowie für von embryonalen Stammzellen abgeleiteten somatischen Zellen. Möglicherweise kommen aber auch andere zelluläre Modellsysteme hinzu, die von anderen Bausteinen des Forschungsclusters zur Verfügung gestellt werden. Zu solchen funktionellen Parametern gehören die i) elektrische Aktivität (EKG-ähnliche, MEA),  ii) Impedanzmessungen, iii) Bildgebung sowie iv) zellspezifische funktionelle Readouts wie Enzymaktivitäten, die Zytokinfreisetzung, Albumin- und Harnstoff-Sekretion, Glykogen-Aufnahme, Cholestase, Steatose sowie Protein­freisetzung von Zielzellen.
  • Entwicklung von „-omics“-Techniken für humane in vitro-Modelle für Leber und Herz, sowie für von embryonalen Stammzellen abgeleiteten somatischen Zellen – möglicherweise auch für andere, innerhalb von SEURAT-1 benötigte Modellsysteme. Diese „-omics“-Analysen umfassen die i) integrative Transkriptomanalyse (Microarrays für die Überprüfung der globalen Genexpression, Epigenetik und miRNA), ii) Proteomics und iii) Metabonomics.
  • Entwicklung von Konzepten für einen standardisierten Ansatz, der es erlaubt i) die besten Kandidaten für Toxizitäts-Einschätzungen, besonders im Hinblick auf deren Reproduzierbarkeit (Biomarker-Qualifikation) und ii) die Unterscheidung sensitiver und zielgerichteter, spezifischer Biomarker von generischen zellulären Stresseffekten zu identifizieren.
  • Integration funktioneller Techniken mit „-omics“-Techniken in in vitro-Modellsystemen unter Berücksichtigung der Reversibilität toxischer Effekte beziehungsweise Bestimmung etwaiger Schwellenkonzen­trationen für chemische Stressfaktoren, die steigende Schweregrade biologischer Reaktionen definieren.   
  • Qualifikation von Biomarkern (nachweisliche Prozesse, die identifizierte Biomarker mit spezifischen klinischen Beobachtungen verknüpfen); Aspekte der Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit der einzelnen Messwerte und sonstige Anforderungen für die regulatorische Akzeptanz von Biomarkern.
  • Systematische Datenaufbereitung unter Einsatz standardisierter Nomenklatur, um den Online-Austausch von Biomarker-Metadaten zu ermöglichen.
  • Formulierung GLP-konformer SOPs für Verfahren, die der Identifizierung der robustesten, prädiktiven Biomarker dienen.

Ansatz

Derzeit sind keine verfügbaren Alternativen zu Tierversuchen zur Erfassung der Toxizität nach wiederholter Exposition (z.B. entsprechend 28- oder 90-tägigen in vivo-Studien nach OECD TG407/408) für regulatorische Zwecke akzeptiert. Eine 2002 eingerichtete ECVAM-Arbeitsgruppe für Chemikalien wies darauf hin, dass „die Verfügbarkeit von in vitro-Modellen für Langzeittestungen zur Validierung davon abhängt, welche Fortschritte bei der Erforschung und Entwicklung von Tests gemacht werden“1.

Klassische in vitro-Zytotoxizitätstests sind nicht geeignet für den Nachweis von Wirkungen bei wiederholter Gabe, da sie auf späte Ereignisse während des Zelltods fokussiert sind. Zudem sind sie vor allem mit nekrotischen oder apoptotischen Prozessen assoziiert2. Da wesentliche subletale Effekte im Zusammenhang mit niedrigdosierter Exposition nicht durch herkömmliche Zytotoxizitätstests erkannt werden, müssen neue Technologien angewandt werden, die das Erkennen von Nebenwirkungen in einer frühen Phase der Toxizität ermöglichen, zum Beispiel HCS-Plattformen oder die Anwendung fluoreszenzbasierter Reagenzien, mit denen zelluläre Targets und physiologische Prozesse quantitativ analysiert werden können. Die meisten toxikologischen in vitro-Assays liefern eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für eine bestimmte Kombination der Prüfsubstanz und das zelluläre System. Solche Dosis-Wirkungs-Beziehungen können aber nicht die dynamischen Aspekte der Zellantwort auf ein Toxin erfassen, oder die Erholung der exponierten Zellen nach dem Entzug der Testsubstanz (Reversibilität). Bisher basieren die meisten Methoden zum Toxizitäts-Screening auf Messungen nicht-diskriminierender toxikologischer Endpunkte (z.B. Zelltod, MTT-Assay), die keine chemikalienspezifischen Effekte berücksichtigen. Und doch beeinflussen verschiedene Chemikalien unterschiedliche essentielle zelluläre Prozesse auf subzellulärer Ebene.

Tatsächlich zeigen Analysen toxikogenomischer Daten, wie etwaige Stoffe und Verbindungen eine Vielzahl von zellbiologischen Prozessen beeinflussen. Bisher können diese unterschiedlichen Prozesse nicht durch einen einheitlichen toxikologischen Endpunkt bestimmt werden. Jüngste Fortschritte in der automatisierten Fluoreszenzmikroskopie, quantitativen Multi-Parameter-Bildanalyse und im Data Mining in Kombination mit BAC-Recombineering erlauben heute eine effiziente GFP-Markierung eines Gens in seinem eigenen genomischen Kontext, so dass eine physiologische Expression des markierten Proteins ermöglicht wird.

Die regulatorische Akzeptanz und Nutzung von Biomarkern ist eine Aufgabe, die noch bewältigt werden muss. So bedarf es einer Reihe von Qualitätsprüfungen, um die wissenschaftliche Gültigkeit der vorgeschlagenen Biomarker zu belegen – benötigt werden etwa Informationen über die Vorhersagekraft des Biomarkers selbst, aber auch über die Methoden, mit denen diese bestimmt wird.

In einem Ende vergangenen Jahres veröffentlichten Berichtentwurf (vgl. http://ec.europa.eu/consumers/sectors/cosmetics/documents/public_consultation/index_en.htm) bewerteten ausgewählte Experten den Status und die Perspektiven der alternativen Methoden und lieferten eine wissenschaftlich fundierte Einschätzung der benötigten Zeit, um den vollständigen Ersatz von Tierversuchen zu erreichen. Zusammenfassend bestätigen die Experten, dass noch mindestens 7 bis 9 Jahre für den Ersatz der gegenwärtigen in vivo-Tierversuche für die Bewertung der Sicherheit kosmetischer Inhaltsstoffe zur Sensibilisierung der Haut zu veranschlagen sind. Allerdings waren die Experten auch der Meinung, dass alternative Methoden vielleicht noch vor 2017 in der Lage sein könnten, Gefährdungen zu beurteilen, also zwischen Sensitisern und Non-Sensitisern zu differenzieren. Dies würde jedoch kein vollständiges Bild dessen zeichnen, was eine sichere Exposition ist, da die relative Wirksamkeit eines Sensitizers nicht bekannt wäre. Für die Toxikokinetik wurde ein Zeitrahmen von 5 bis 7 Jahren angenommen, um Modelle zu entwickeln, die die Lungenabsorption und Nieren- oder Gallen-Exkretion vorhersagen können – und noch länger, um die Verfahren so zu integrieren, dass sie toxikokinetische Tiermodelle vollständig ersetzen können. Für die systemischen toxikologischen Endpunkte der Toxizität bei wiederholter Gabe, Karzinogenität und Reproduktionstoxizität gaben die Experten an, den Zeitrahmen für einen vollständigen Ersatz nicht abschätzen zu können.

Die „Systemische Toxikologie“ wurde als eine neue Disziplin vorgeschlagen, um einen großen Schritt in Richtung der Entwicklung alternativer, humaner Sicherheitstests zu gehen. Abbildung 1 zeigt, wie verschiedene Technologien interagieren und so schließlich zur Entwicklung der „Systemischen Toxikologie“ führen können, etwa durch die Kombination von: „im Wesentlichen verschiedener neuer, informativer Technologien […] mit etablierten wissenschaftlichen Kenntnissen (über biochemische Stoffwechselwege; von Toxizitätsmustern und -signaturen; Wissen über Biomarker; Kenntnis der pharmakokinetischen und chemischen Eigenschaften) mit Hilfe rechenbetonter Ansätze“4.

Das DETECTIVE-Projekt wird mögliche Biomarker hervorbringen, die für die Abschätzung der Toxizität bei wiederholter Gabe relevant sind. Dies geschieht mittels in vitro-Modellen humaner Gewebe und Zellen (abgeleitet von primären Zellen oder von Stammzellen abgeleiteten somatischen Zellen oder Zelllinien), einschließlich Hepatozyten, Kardiomyozyten und Nierenepithelzellen oder anderen Zellen von toxikologischer Relevanz sowie mit Hilfe gut definierter, relevanter Testsubstanzen.

Im Hinblick auf die Langzeittoxizität oder Toxizität bei wiederholter Gabe ist es von besonderer Bedeutung, in der Lage zu sein, frühe Toxizitäts-Marker bei niedriger Dosierung zu detektieren, die nicht direkt zu akuter Toxizität führen.

Durch die Anwendung sensitiver „-omics“-Technologien zur Bewertung chemisch induzierter Veränderungen der zellulären Biochemie und durch Korrelation dieser Informationen mit für die zelluläre Funktion relevanten, sensitiven Endpunkten (d.h. gezielte Endpunkte mit bekannter Bedeutung) – und umgekehrt – wird das DETECTIVE-Konsortium in der Lage sein, wichtige gesundheitsschädliche Nebenwirkungen zu identifizieren, welche dann weiter auf ihre Eignung als relevante Biomarker für Toxizität bei wiederholter Gabe eingeschätzt werden können.

Das Potential einer solchen Kombination aus „-omics“-Technologien mit organotypischen in vitro-Modellen, die weitere mechanistische Einblicke in zelluläre Antworten auf chemische Beeinträchtigungen verspricht, die hochsensitiv und spezifisch sein können, wurde bereits im ECVAM-Workshop 56 unterstrichen1.

Literatur

  1. Pietro P. et al., The Assessment of Repeated Dose Toxicity In Vitro: A Proposed Approach. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 56. ATLA 34, 315–341, 2006.
  2.  Vinken M, Decrock E, De Vuyst E, Leybaert L, Vanhaecke T, Rogiers V., Altern Lab Anim. 2009 Apr;37(2):209-18.
  3. Adler S, Basketter D, Creton S, Pelkonen O, van Benthem J, Zuang V, Andersen KE, Angers-Loustau A, Aptula A, Bal-Price A, Benfenati E, Bernauer U, Bessems J, Bois FY, Boobis A, Brandon E, Bremer S, Broschard T, Casati S, Coecke S, Corvi R, Cronin M, Daston G, Dekant W, Felter S, Grignard E, Gundert-Remy U, Heinonen T, Kimber I, Kleinjans J, Komulainen H, Kreiling R, Kreysa J, Leite SB, Loizou G, Maxwell G, Mazzatorta P, Munn S, Pfuhler S, Phrakonkham P, Piersma A, Poth A, Prieto P, Repetto G, Rogiers V, Schoeters G, Schwarz M, Serafimova R, Tähti H, Testai E, van Delft J, van Loveren H, Vinken M, Worth A, Zaldivar JM., Arch Toxicol. 2011 May;85(5):367-485. Epub 2011 May 1.
  4. Hartung T., Leist M., Food for Thought... on the Evolution of Toxicology and the Phasing out of Animal Testing. First publ. in: Altex 25 (2008), 2, pp.91-96
  5. Ankley GT, Bennett RS, Erickson RJ, Hoff DJ, Hornung MW, Johnson RD, Mount DR, Nichols JW, Russom CL, Schmieder PK, Serrrano JA, Tietge JE, Villeneuve DL., Environ Toxicol Chem. 2010 Mar;29(3):730-41. Review.


Korrespondenzadresse:

Jürgen Hescheler

Klinikum der Universität zu Köln
Institut für Neurophysiologie

Robert-Koch-Str. 39
50931 Köln

Tel.: +49-(0)221-478-6960

j.hescheler[at]uni-koeln.de

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