Antikörper als Biomarker in der Diagnostik

Immunoassays spielen in der klinischen Diagnostik eine wichtige Rolle. Voraussetzung für die Entwicklung eines Immunoassays ist die Identifizierung geeigneter Markermoleküle, zum Beispiel von Antikörpern. Im Rahmen eines Kooperationsprojektes konnten wir Antikörpermarker identifizieren, die für die Entwicklung eines diagnostischen Tests zur Früherkennung von Komplikationen nach einer Nierentransplantation vielversprechend erscheinen. Um ihre Eignung für diagnostische Applikationen zu evaluieren, charakterisieren wir derzeit die Bindungs­kinetik der Antikörper-Antigen-Interaktionen mit Hilfe des Array-basierten Flexchip-Systems (Biacore). Mit diesem können bis zu 400 Antikörper-Antigen-Interaktionen parallel gemessen und hinsichtlich ihrer kinetischen Parameter klassifiziert werden. Die Assoziationsrate gibt dabei Aufschluss über die Länge der Inkubationszeit des Assays, während die Dissoziationsrate und die Gleichgewichtskonstante zur Einschätzung der Stabilität des Komplexes dienen. Ein kinetisches Ranking erlaubt die Identifizierung eines Antikörper-Markers, der zugleich eine hohe Stabilität zu seinem Antigen aufweist sowie nur eine kurze Inkubationszeit für die Bindung benötigt.

Die Anforderungen, die an moderne Diagnostikverfahren gestellt werden, sind heute hoch. Einerseits sollen sie zur frühzeitigen Krankheitserkennung und Klassifizierung der Erkrankung beitragen, andererseits sollen sie zu einer verbesserten Prognose des Krankheitsverlaufes beitragen. Neue Verfahren zielen auf ein Monitoring der Therapie ab, um den Genesungsprozess verfolgen zu können und Behandlungserfolge sicherzustellen. Insbesondere bei Erkrankungen, die sich aufgrund ähnlicher Symptomatik kaum unterscheiden lassen, gewinnen Biomarker als Indikatoren für ein bestimmtes Krankheitsstadium daher immer mehr an Bedeutung. Für die Differentialdiagnose und die Prognose weisen Biomarker aus dem Serum entscheidende Vorteile auf: Sie sind bereits oft vor dem Auftreten erster Symptome im Blut nachweisbar, und die routinemäßige Blutentnahme ist einfach und schnell.

Prognosefaktoren für  die Transplantatabstoßung

Einen bedeutenden Fortschritt in der Transplantationsmedizin versprechen Serummarker, mit denen sich Komplikationen, wie das Risiko einer Abstoßung nach einer Nierentransplantation, frühzeitig prognostizieren lassen. Die Niere ist mit schätzungsweise 40.000 Transplantationen jährlich das meisttransplantierte Organ weltweit. Allein in Deutschland wurden im Jahr 2009 mehr als 2.700 Nieren transplantiert. Als eine schwerwiegende Komplikation entwickelt sich bei nierentransplantierten Personen häufig eine BK-Virus-Reaktivierung. Die Durchseuchung der Bevölkerung mit diesem Virus liegt bei 90%. Die Hälfte aller Transplantationspatienten erkrankt an einer BKV-Infektion. Knapp 50% von ihnen erleiden einen Transplantatverlust.

In dem Kooperationsprojekt NephroFit der Berliner Humboldt-Universität, der Charité und dem MPI für molekulare Genetik wird gezielt nach Antikörpern als Screeningmarkern für die frühzeitige Diagnose sowie Differentialdiagnose von akuter Allotransplantatabstoßung und BK-Virus-assoziierter Abstoßung (BKVA) nach Nierentransplantation gesucht. Eine Allotransplantatabstoßung (AA) kann auftreten, wenn die transplantierte Niere vom Immunsystem als „fremd“ erkannt wird und eine Immunantwort ausgelöst wird. Bei einer BK-Virus-assoziierten Abstoßung wird die Niere aufgrund der Reaktivierung des BK-Virus, das sich im Harntrakt manifestiert, abgestoßen. Eine frühzeitige Diagnose, verbunden mit einer Differenzierung, würde das Risiko für eine Transplantatabstoßung erheblich senken. Problematisch ist aber, dass sich die Allotransplantatabstoßung klinisch kaum von der BK-Virus-assoziierten Abstoßung unterscheiden lässt und eine Differentialdiagnose daher in der Regel erst zu einem Zeitpunkt der Erkrankung erfolgt, an dem bereits oft irreversible Gewebeschäden in der Niere aufgetreten sind und der Handlungsspielraum für eine gezielte Therapie stark eingeschränkt ist. Im Fall einer Allotransplantatabstoßung muss die Dosierung der Immunsuppressiva erhöht werden, um die Aktivität des Immunsystems stärker zu supprimieren. Besteht dagegen das Risiko einer BK-Virus-assoziierten Abstoßung wird die Gabe der Immunsuppressiva herabgesetzt, damit das Immunsystem die Virusinfektion bekämpfen kann.

Immunoassay als diagnostisches Tool

Um geeignete Marker für diagnostische Immuno­assays zu identifizieren, werden im Rahmen unserer Forschungsarbeit Serum-Screenings von Peptidbibliotheken mittels Protein-und Peptid-Microarrays durchgeführt und die Bindung von Antikörpern an die Peptide mittels Fluoreszenz detektiert. Die Interaktionen der selektierten Kandidatenpeptide mit den Serum­antikörpern werden dann hinsichtlich ihrer kinetischen Parameter charakterisiert, um den Antikörper-Peptid-Komplex mit der höchsten Stabilität auszuwählen und die optimalen Assaybedingungen zu ermitteln.

Validierung der  Antikörper-Peptid-Interaktion

Die Kinetik der Antikörper-Peptid-Interaktion wurde mit Hilfe des Microarray-basierten Flexchip-Systems (Biacore) untersucht. Dabei findet der Interaktionsprozess in einer Flusszelle statt und kann in Echtzeit verfolgt werden (Abb. 1A). Die resultierende Änderung des Reflexionswinkels ist proportional zur Massenänderung auf der Oberfläche und wird als „Resonance Units“ (RU) in einem Sensogramm visualisiert. Der Interaktionsprozess unterteilt sich in Assoziationsphase, Gleichgewicht und Dissoziationsphase, gefolgt von einer Regeneration der Oberfläche (Abb. 1B). Aus den Messpunkten der Graphen können die kinetischen Messwerte bestimmt werden.

Der große Vorteil gegenüber anderen SPR (surface plasmon resonance)-Systemen besteht darin, dass bis zu 400 Antikörper-Peptid-Interaktionen parallel gemessen und diese hinsichtlich ihrer Assoziations- (ka) und Dissoziationsrate (kd) sowie Gleichgewichtskonstante (KD) miteinander verglichen werden können. Die Assoziationsrate beschreibt die Komplexbildung und kann als Indiz dafür dienen, wie lang die Inkubationszeit für den Assay gewählt werden muss, um den größten Anteil an Antikörpern zu binden. Im Vergleich dazu ist die Dissoziationsrate ein Maß für die Zerfallsgeschwindigkeit des Antikörper-Peptid-Komplexes und spiegelt die Stabilität der Bindung wider. Die Gleichgewichtskonstante charakterisiert die Affinität des Antikörpers zum Peptid. Diese Parameter könnten für die Einstellung geeigneter Pufferbedingungen beim Test herangezogen werden.

Die kinetische Messung am Flexchip wurde anhand eines Modellsystems etabliert, das aus dem CB4-1-Antikörper und fünf Peptiden mit sehr unterschiedlichen Affinitäten bestand (Abb. 2). Als Vorversuch wurde die Bindung des CB4-1-Antikörper an die Peptide mittels Peptid­array und Fluoreszenzdetektion getestet (Abb. 2A). Die unterschiedlichen Signalintensitäten für die einzelnen Peptide bei identischer Peptidkonzentration zeigten, dass unterschiedliche Mengen an Antikörper gebunden wurden. Allerdings konnte keine Aussage über die zeitliche Entwicklung der Interaktion hinsichtlich der Geschwindigkeit der Komplexbildung und dem Erreichen des Gleichgewichtszustand sowie bezüglich der Stabilität des Komplexes getroffen werden. Die Signalintensität zwischen Peptid 2 und 3 war sehr gering. Gleichwohl wurden mit Hilfe der SPR-Analyse die Unterschiede in den Interaktionskinetiken deutlich (Abb. 2B). Obwohl identische Mengen der Peptide immobilisiert wurden, band quantitativ mehr CB4-1 Antikörper an Peptid 1 als an die anderen Peptide. Die Bindungskinetik von CB4-1 mit Peptid 1 zeigte im Vergleich zu den anderen Interaktionen eine langsamere Assoziation und erreichte den Gleichgewichtszustand zu einem späteren Zeitpunkt, CB4-1 dissoziierte jedoch deutlich langsamer als bei den anderen Komplexen.

Somit stellte die Bindung von CB4-1 an Peptid 1 die stabilste Interaktion dar. Des Weiteren zeigen die Daten, dass die Bindung von CB4-1 und Peptid 2 eine geringfügig schnellere Assoziation und eine etwas langsamere Dissoziationsphase hatte als die Interaktion des Antikörpers mit Peptid 3. Im Vergleich dazu hat der Antikörper nicht an die Peptide 4 und 5 gebunden. Die charakteristischen Merkmale der Kinetik spiegelten sich in der ka- und kd-Rate sowie dem KD-Wert wider (Abb.2C).

Eine schnelle Komplexbildung (hohe ka-Werte) ist in diesem Zusammenhang von Vorteil, um die Inkubationszeit des Immuntests zu verkürzen und dadurch unspezifische Interaktionen zu reduzieren. Interaktionen mit kleineren kd-Werten (geringere Komplexzerfallsrate) deuten auf eine hohe Stabilität hin. Dieses Kriterium ist entscheidend für die Länge der Testdauer und könnte die Wahl und Stringenz geeigneter Waschbedingungen erleichtern. Mit Hilfe eines ka/kd-Plots können die Interaktionen nach Geschwindigkeit der Komplexbildung und Stabilität klassifiziert werden. Dabei gehören Interaktionen, die im oberen linken Viertel des Diagramms lokalisiert sind, zu den schnellsten Interaktionen mit der größten Stabilität. Darüber hinaus ermöglicht die Evaluierung der KD-Werte eine Aussage über die Affinität des Antikörpers zu seinem Peptid. Insofern erlauben die Messungen am Flexchip die Unterscheidung der kinetischen Parameter der einzelnen Antikörper-Peptid-Interaktionen und ermöglichen dadurch eine Klassifizierung. Für einen potentiellen Test können Marker ausgewählt werden, die eine schnelle Assoziationsphase und die höchste Affinität haben sowie die größte Komplexstabilität aufweisen. Dadurch kann die Inkubationszeit des Assays kurz gehalten werden und die Antikörper-Peptid-Interaktion über die gesamte Messung stabil erhalten bleiben.

Die detaillierte Validierung von Antikörpern hinsichtlich ihrer kinetischen Parameter erlaubt die Selektion des optimalen Biomarkers für ein diagnostisches Testsystem zur frühzeitigen prognostischen Diagnose einer Transplantatabstoßung. Zugleich eröffnet sie die Möglichkeit einer Differentialdiagnose der akuten Allotransplantatabstoßung und der BK-Virus-assoziierten Abstoßung. Eine kontinuierliche Überwachung der Transplantationspatienten erlaubt ein rechtzeitiges Intervenieren und erleichtert die Auswahl und das Anpassen einer geeigneten Therapie. Dadurch kann das Risiko einer Transplantatabstoßung gesenkt werden.

Dipl.-Biol. Katja Köhler, Dr. Harald Seitz, MPI für molekulare Genetik, Berlin und IBMT, Potsdam; Dr. Michal Or-Guil, Institut für Theoretische Biologie, HU Berlin; PD Dr. Nina Babel, Charité Berlin, Schwerpunkt Nephrologie und Internistische Intensivmedizin

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Dr. Harald Seitz

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GenetikFunctional Protein Analysis

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