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Blitzlicht

Stoffwechselanalyse: Neue Wege im Labyrinth entdecken

In Kinderzeitschriften oder Rätselheften findet man häufig Labyrinthe, bei denen man herausfinden soll, auf welchem Weg die Maus zum Käse kommt. Das wissenschaftliche Labyrinth der theoretischen Stoffwechselanalyse heißt „Biochemical Pathways“ von Roche Applied Science und hängt im A0-Format in vielen biochemischen Laboren und Büros. Allerdings ist das Netzwerk der Metabolite noch weitaus komplexer als es dieses Poster vermittelt. Deshalb greifen Stoffwechselforscher mittlerweile immer öfter auf die Hilfe von Computern zurück. Mit Modellen und Simulationen sind sie so in den vergangenen Jahren so manchem zuvor unbekannten Stoffwechselweg auf die Schliche gekommen.

Eine Frage, zu deren Beantwortung die genaue Untersuchung des „Stoffwechsel-Labyrinths“ hilft, ist, ob der menschliche Metabolismus aus Fettsäuren Zucker herstellen kann. So ist zwar seit Jahrzenten bekannt, dass eine Verbindung über den Zitrat-Zyklus (auch: Tricarbonsäure (TCA)-Zyklus oder Krebs-Zyklus) zwischen dem Abbauprodukt der Fettsäuren, Acetyl-CoA, und Glukose existiert. (Es konnte zum Beispiel nachgewiesen werden, dass aus C14-markiertem Acetyl-CoA in der Tat C14-markierte Glukose entstehen kann.) Bei genauerer Betrachtung stellte man jedoch fest, dass aus Fettsäuren keine Nettobildung von Glukose möglich ist. Die Ursache dafür ist, dass zwar durch Acetyl-CoA zwei Kohlenstoffatome in den Zitrat-Zyklusgelangen, aber im Verlaufe des Zitrat-Zyklus auch zwei CO2 verloren gehen (Abb. 1). Da der Stoffwechsel aber sehr komplex ist, kann man sich natürlich fragen, ob vielleicht andere Wege für die Umwandlung von Fettsäuren in Glukose existieren. Und tatsächlich, wenn man das gesamte bekannte Stoffwechselnetzwerk des Menschen in Betracht zieht, findet man einige – wenn auch verschlungene – Wege auf denen Fettsäuren in Glukose umgewandelt werden können4 (Abb. 1). Dieser Reaktionsweg, der Reaktionen aus der Ketogenese verwendet, ist vor allem während des Hungerns von Bedeutung. Unter diesen Umständen können mit seiner Hilfe die Fettsäurereserven von Säugetieren zur Produktion von im Gehirn benötigter Glukose beitragen. So konnten wir zeigen, dass essentielle Enzyme dieses Reaktionsweges in der Hungerphase während der Winterruhe von Schwarzbären verstärkt produziert werden4. So zeigt sich, dass selbst im menschlichen Metabolismus eine genauere Betrachtung des biochemischen Labyrinths neue Erkenntnisse über Reaktionswege liefert.

Ordnung im biochemischen „Chaos“

Wie kann man nun solche Stoffwechselwege in großen metabolischen Netzwerken ausfindig machen? Eine hierfür häufig verwendete Methode ist die Analyse der elementaren Flussmoden7 (Abb. 2). Ein elementarer Flussmodus ist eine minimale Kette von Reaktionen die zum Beispiel von einem gegebenen Ausgangsprodukt, wie Glukose, zu einem bestimmten Zielprodukt, wie Fettsäuren, führen und die mehreren Bedingungen genügen müssen: Reaktionen dürfen nur in der thermodynamisch zulässigen Richtung verwendet werden (Reversibilitätsbedingung) und Zwischenprodukte innerhalb des elementaren Flussmodus müssen im Gleichgewicht sein, also in der gleichen Menge produziert wie verbraucht werden (Gleichgewichtsbedingung). Außerdem kann man einen elementaren Flussmodus nicht in mehrere Teilflüsse zerlegen, die die gleichen Bedingungen erfüllen. Damit sind elementare Flussmoden eine mathematisch exakt definierbare Repräsentation biochemischer Reaktionswege.

Für die Berechnung der elementaren Flussmoden werden die Mengen an Metaboliten, die jede Reaktion verbraucht und produziert, zunächst in einer sogenannten stöchiometrischen Matrix zusammengefasst. Diese Matrix, zusammen mit der Information über die Reversibilität einzelner Reaktionen, dient als Eingabe für Algorithmen zur Berechnung von elementaren Flussmoden. Dabei steigt die Anzahl an gefundenen elementaren Flussmoden exponentiell mit der Anzahl der Reaktionen an. Dies lässt sich leicht an einer Erweiterung des Beispiels aus Abbildung 2 erkennen. Gäbe es nämlich nicht nur ein Enzym, dass A in B umwandeln kann, sondern zwei, so würde sich die Anzahl der Elementarmoden verdoppeln. Denn jeder der in Abbildung 2 (Mitte) dargestellten Elementarmoden könnte entweder mit Enzym 1 oder mit Enzym 2 gebildet werden. Dadurch kommt es bei der Vergrößerung der Netzwerke zu einer sogenannten kombinatorischen Explosion der Anzahl der möglichen Elementarmoden. Die Berechnung aller Elementarmoden in Netzwerken, die den Metabolismus ganzer Organismen umfassen, ist, trotz der inzwischen möglichen Parallelisierung des Algorithmus’, bisher nicht möglich.

Will man Reaktionswege im Gesamtzellstoffwechsel bestimmen, muss man daher auf andere Methoden zurückgreifen. Eine hierfür häufig angewendete Methode ist die sogenannte Flussbilanzanalyse (FBA). FBA beruht auf einer Optimierungsmethode. Deshalb ist es notwendig, ein Optimierungskriterium festzulegen. So analysiert man zum Beispiel, auf welchen Reaktionswegen der Körper aus Glukose eine maximale Menge eines bestimmten Zielmetaboliten bilden kann. Mit FBA können – im Gegensatz zur Elementarmodenanalyse – nicht alle möglichen Reaktionswege gefunden werden. Dafür ist die Berechnung von Reaktionswegen auch in großen Stoffwechselnetzwerken möglich.

Neue Wege in der Krebstherapie

Die Analyse elementarer Flussmoden und die FBA sind wichtige Werkzeuge, um die Auswirkungen der Störung bestimmter Enzyme im Stoffwechsel zu simulieren. Dies umfasst zum einen die Simulation der Auswirkung von Enzymdefekten als auch die Suche nach Schlüsselenzymen, die als Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Therapien gegen Krankheiten dienen können. Ein Beispiel dafür ist die Krebstherapie. Ein häufig in Krebszellen beobachtetes Phänomen ist der sogenannte Warburg-Effekt, bei dem Krebszellen Glukose und andere Substrate nicht, wie unter aeroben Bedingungen üblich, vollständig veratmen sondern als Laktat ausscheiden. Durch Berechnung der elementaren Flussmoden in einem den zentralen Metabolismus von Krebszellen umfassenden Modells, konnten wir die Alanin-Aminotransferase (ALAT) als ein wichtiges Enzym identifizieren, dass die Weichen hin zum Warburg-Effekt stellt1. Durch die Zugabe von verschiedenen Inhibitoren der ALAT, konnten wir zeigen, dass durch Perturbation dieses Schlüsselenzyms der Warburg-Effekt reduziert und das Wachstum der Tumorzellen vermindert werden kann.

Auf der Suche nach NAD-Synthesewegen

Ein weiteres Problem, dem wir in den vergangenen Jahren nachgegangen sind, ist, aus welchen Vorstufen Niktotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) synthetisiert werden kann und wie sich diese Synthesewege in verschiedenen Organismen unterscheiden2-3. NAD ist vor allem als Cosubstrat für Redoxreaktionen bekannt. Hierbei wird es reversibel in NADH umgewandelt, aber nicht verbraucht. NAD ist jedoch auch an einer Vielzahl von Signaltransduktionsreaktionen beteiligt. Bei diesen Reaktionen wird NAD jedoch zu Nikotinamid (Nam) abgebaut. Deshalb muss NAD ständig neu synthetisiert oder aus Nam recycelt werden.

Um die NAD-Synthesewege genauer zu untersuchen, haben wir zunächst alle bekannten Reaktionen dieses Stoffwechselweges in Hefe und Mensch rekonstruiert (vereinfachte Übersicht siehe Abb. 3) und die elementaren Flussmoden in diesem Netzwerk berechnet. So konnten wir feststellen, dass es in der Hefe doppelt so viele Synthesewege für NAD wie im Menschen gibt. Dies ist insofern erstaunlich, da Menschen viel mehr NAD-abbauende Enzyme wie z.B. Sirtuine und Poly-ADP-Ribosyltransferasen besitzen. Bei der Analyse der NAD-Synthese in Hefe und Mensch ist außerdem auffällig, dass zwei unterschiedliche Recyclingwege von Nam zu NAD verwendet werden. Der im Menschen existierende Weg ist dabei deutlich effizienter. Daher wollten wir in einer weiteren Studie klären, wie sich die NAD-Synthesewege evolutionär entwickelt haben und ob die beiden Recyclingwege in einigen Organismen gemeinsam auftreten. Bisher wurde angenommen, dass dies nicht der Fall ist6. Wir konnten jedoch zeigen, dass es Organismen gibt, in deren Genom die beiden Wege kodiert sind. Ob die entsprechenden Enzyme jedoch gleichzeitig exprimiert werden, ist noch unklar.

Die phylogenetischen Analysen zeigten außerdem, dass das Enzym NAD-Kinase, welches NAD in NADP umwandelt, bei allen untersuchten Organismen vorhanden ist und NADP daher scheinbar für alle Organismen notwendig ist. Die einzige Ausnahme bildet die Spezies Chlamydia trachomatis, die eine parasitische Lebensweise aufweist und NADP vom Wirt aufnimmt. 

Was passiert, wenn sich das Labyrinth kontinuierlich verändert

In unserer phylogenetischen Untersuchung konnten wir auch zeigen, dass fast alle Organismen eine sogenannte de novo-Synthese von NAD aus Aminosäuren durchführen können. Im Menschen wird dazu Tryptophan benötigt. In Experimenten war es jedoch nicht möglich Vitamin B3 (bestehend aus Nikotinsäure und Nikotinamid) durch Tryptophan zu ersetzen5. Um nun der Frage nachzugehen, warum die de novo-Synthese aus Tryptophan Vitamin-B3-Gaben nicht ersetzen kann, reichen die bisher beschriebenen Methoden nicht aus. Die oben ausgeführten Analysen beruhen auf stöchiometrischen Reaktionsgleichungen und können nicht klären, in welchem Umfang ein Reaktionsweg unter physiologischen Bedingungen genutzt wird. Wenn man außerdem untersuchen möchte, wie sich die Dynamik des Stoffwechselweges unter bestimmten Bedingungen ändert, benötigt man dynamische Modelle. Da die Rekonstruktion dynamischer Modelle die Einbindung experimentell gemessener kinetischer Parameter beinhaltet, ist sie mit hohem manuellem Aufwand verbunden und auf kleinere Stoffwechselnetzwerke beschränkt. Sind kinetische Modelle jedoch einmal erstellt, kann man mit Ihnen eine sehr genaue Analyse des Stoffwechselweges durchführen. Bei unserer Analyse des Tryptophanstoffwechsels im Menschen konnten wir dadurch feststellen, dass die Expression der beteiligten Enzyme nicht ausreichend ist, um Vitamin B3 durch Tryptophan zu ersetzen (unveröffentliche Ergebnisse). Da der Tryptophanstoffwechsel auch eine große Rolle bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen spielt, haben wir außerdem krankheitsbedingte Veränderungen in diesem Stoffwechselweg untersucht und mögliche pharmakologische Zielenzyme analysiert (Manuskript in Vorbereitung).

Der Schlüssel zum Labyrinth

Die theoretische Stoffwechselanalyse stellt ein nützliches Werkzeug dar, um Reaktionswege in komplexen Stoffwechselmodellen zu identifizieren. Ausgehend von dieser Methode können verschiedenste wichtige Fragen in Bezug auf Reaktionswege und deren Störung in metabolischen Netzwerken untersucht werden. So können die Auswirkungen von Enzymdefekten untersucht, mögliche Zielenzyme für die Behandlung von Krankheiten identifiziert und das biochemische Repertoire an Reaktionswegen im Vergleich über mehrere Organismen untersucht werden. Außerdem bildet diese Methode die Grundlage dafür, detailliertere kinetische Modelle zu erstellen, mit denen auch Dynamiken in diesen Reaktionswegen untersucht werden können.

Literatur

[1] Beuster, G., K. Zarse, et al. (2011). „Inhibition of alanine aminotransferase in silico and in vivo promotes mitochondrial metabolism to impair malignant growth.“ J Biol Chem 286(25): 22323-22330.
[2] de Figueiredo, L. F., T. I. Gossmann, et al. (2011). „Pathway analysis of NAD+ metabolism.“ Biochem J 439(2): 341-348.
[3] Gossmann, T. I., M. Ziegler, et al. (2012). „NAD(+) biosynthesis and salvage--a phylogenetic perspective.“ FEBS J 279(18): 3355-3363.
[4] Kaleta, C., L. F. de Figueiredo, et al. (2011). „In silico evidence for gluconeogenesis from fatty acids in humans.“ PLoS Comput Biol 7(7): e1002116.
[5] Nikiforov, A., C. Dolle, et al. (2011). „Pathways and subcellular compartmentation of NAD biosynthesis in human cells: from entry of extracellular precursors to mitochondrial NAD generation.“ J Biol Chem 286(24): 21767-21778.
[6] Rongvaux, A., F. Andris, et al. (2003). „Reconstructing eukaryotic NAD metabolism.“ Bioessays 25(7): 683-690.
[7] Schuster, S., D. A. Fell, et al. (2000). „A general definition of metabolic pathways useful for systematic organization and analysis of complex metabolic networks.“ Nat Biotechnol 18(3): 326-332.

Korrespondenzadressen

Christoph Kaleta
Arbeitsgruppe Theoretische Systembiologie
Friedrich Schiller-Universität Jena
Leutragraben 1, 07743 Jena
christoph.kaleta@uni-jena.de

Ines Heiland
Lehrstuhl für Bioinformatik
Friedrich Schiller-Universität Jena
Ernst-Abbe-Platz 2, 07743 Jena

(ab Dezember 2012) 
Department of Arctic and Marine Biology, University of Tromsø, Naturfagbygget
Dramsvegen 201, 9037 Tromsø, Norway
heiland.ines@uni-jena.de

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