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Blitzlicht

Adhärente Zellkultur im „hängenden Tropfen“

Die Stammzellforschung ist eines der vielversprechendsten Gebiete der Biomedizin. Allerdings stehen immer noch nicht ausreichend Protokolle zur Verfügung, die eine hinreichend effiziente Expansion und gezielte Differenzierung erlauben. Insbesondere trifft dies auf die humanen embryonalen Stammzellen zu. Hier ist die Suche nach Differenzierungsmolekülen mit den gebräuchlichen manuellen Zellkulturmethoden zeitaufwendig und nicht zuletzt immer noch ein „Glücksspiel“. Auch die möglichen kombinatorischen Effekte auf die Entwicklung einer Zellkultur bei zwei oder drei molekularen Kandidatenfaktoren können aufgrund der Vielzahl der Möglichkeiten nur sehr oberflächlich untersucht werden. 

Eine neue „alte“ Technologie hat nach unserer Einschätzung allerdings großes Potential bei der Bewältigung der beschriebenen Aufgabe. Der „Hängende Tropfen“ (Hanging Drop) ist als Kultivierungsmethode mehr als hundert Jahre im Einsatz und wurde schon zu Anfang des letzten Jahrhunderts zum Halten von Nervenzellen und für Untersuchungen der Embryonalentwicklung eingesetzt. Nahezu unverändert ist die Methode der Herstellung des „Hängenden Tropfens“: Er wird auf dem Deckel einer Petrischale plaziert, die dann mit geschickten Händen umgedreht wird und so einen Mini-Bioreaktor mit einem Volumen von wenigen 10 Mikrolitern ohne Anhaftungsflächen für Zellen schafft. Das geringe Volumen ist prädestiniert für einen ressourcenschonenden Kultivierungsvorgang und trotzdem ausreichend, um statistisch abgesicherte Versuche durchzuführen.

Zudem ist eine perfekte und nahezu gradientenfreie Versorgung mit Gas gewährleistet, da die Zellen direkt an der Flüssig-Gasgrenzfläche kultiviert werden. Eventuellen Volumenänderungen des Tropfens lässt sich über eine Umgebung mit definierter Luftfeuchtigkeit entgegenwirken (zum Beispiel durch die Verwendung von Flüssigkeitsreservoirs direkt unter den Tropfen). Viele etablierte Differenzierungsprotokolle für Stammzellen, so zum Beispiel die Bildung von Kardiomyozyten (Herzmuskelzellen) basieren auf dieser Methode.

Es wurden schon vor einiger Zeit von anderen Gruppen sehr erfolgreiche Ansätze zur Automatisierung durchgeführt, da sich die Zellen auch nach der Kultivierung im Tropfen ohne Zugabe von Enzymen (wie etwa Trypsin) weiterverwenden lassen. Eine Adhäsion der Zellen am Kultivierungsgefäß findet hier nicht statt, sondern die Zellen aggregieren untereinander und bilden eine Art Mikrogewebe oder Sphäroid.

Da die Adhäsion an fremden Oberflächen aber für viele Zellen eine physiologische Grundbedingung ist, differenzieren sie, sobald diese verlorengeht, die  Zellen verlieren ihre charakteristischen Eigenschaften, oder es kommt gar zum programmierten Zelltod. Wir entschlossen uns daher als neuen Ansatz das 3D-System Hanging Drop mit dem klassischen 2D-Ansatz der Zellkultur zu kombinieren. Dazu wurden Microcarrier – kleine Trägermatrizen mit einem Durchmesser von 150 bis 200 µm – in jeden einzelnen Tropfen gegeben und so den Zellen eine biokompatible (und somit auch funktionalisierbare) Oberfläche angeboten.

Die Zellen können auf einem oder mehreren Microcarriern anwachsen, zugleich ist aber die Kultivierung innerhalb des aufgrund seiner Größe leicht kontrollier- und standardisierbaren Tropfens möglich. Dabei konnten wir beobachten, dass die Zellen nach der Adhäsion schnell wieder mit der Zellteilung beginnen. Während der Proliferation vereinnahmen sie immer weitere Microcarrier, so dass ein ständig wachsendes Zell-Microcarrier-Aggregat entsteht. Es ist jedoch entscheidend, dass zu Beginn der Kultur im Hanging Drop die Zahl an Zellen pro Microcarrier nicht zu gering ist, damit ausreichend Zell-Zell-Kontakte ausgebildet werden können. Dies eröffnet zusätzlich die Möglichkeit durch eine schrittweise Zugabe der Microcarrier eine dynamische Expansion der Zellen zu erreichen, so dass die Proliferationskapazität ständig erhöht werden kann.

Die Bildung der Zell-Microcarrier-Aggregate führt auch zur Entstehung einer speziellen Mikroumgebung („Nische“), wodurch die Effizienz der Differenzierungsprotokolle möglicherweise erhöht werden kann, da die physiologischen Bedingungen im menschlichen Körper simuliert werden. Für eine reproduzierbare und standardisierte Anwendung dieser Methode stellt hierbei die Anzahl der Microcarrier pro Tropfen den kritischen Parameter dar, da momentan eine gleichmäßige Verteilung noch nicht gewährleistet werden kann.

Allerdings ist die „Hängender Tropfen“-Kultur noch sehr zeit- und arbeitsaufwendig, da zum Beispiel für eine längere Kultivierung von Zellen ein regelmäßiger Mediumwechsel notwendig ist. Dazu muss der Deckel mit den Tropfen vorsichtig gedreht und anschließend manuell das Medium jedes einzelnen Tropfens erneuert werden, ohne die Zellen zu verlieren. Um also die Vorteile der „Hängender Tropfen“-Kultur für eine breitere und größere Anwendung nutzbar zu machen, ist eine Automatisierung des Prozesses unerlässlich.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten der automatischen Zugabe von Faktoren in einen derartigen Hanging Drop-Bioreaktor, eine bereits umgesetzte ist in Abbildung 1 A und B gezeigt. Jede Manipulation des Tropfens, vom Mediumwechsel über die Zugabe von Faktoren bis hin zur Ernte, kann durch die Verwendung einer speziellen Zellkulturplatte über eine Öffnung auf der Oberseite des Tropfens realisiert werden. Hierfür können die Vorzüge des breiten Angebotes und der unterschiedlichen Spezifikationen an Pipettier-Plattformen genutzt werden, so dass ein Großteil der manuellen Arbeit automatisiert und standardisiert werden konnte.

Wir konnten damit nun im Rahmen des EU-Projektes HYPERLAB zeigen, dass humane embryonale Stammzellen ohne Verlust ihrer Pluripotenz im adhärenten Zustand im modifizierten „Hanging Drop“ für 10 Tage kultiviert werden konnten (Abb. 1 C-F). Zusätzlich konnten wir durch die Einbindung von Pipettierrobotern eine vollständige Automatisierung des Systems unter der Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und humanen adulten Stammzellen demonstrieren.

Kryokonservierung

Durch die Entwicklung neuartiger Methoden im Bereich der Kryokonservierung, wie zum Beispiel der oberflächenbasierten Vitrifikation3 oder vollständig proteinfreier Kryomedien4, ist anschließend eine sichere und effiziente Lagerung der Zellen direkt im Tropfen möglich. Bei der oberflächenbasierten Vitrifikation könnten die Hanging Drop-Bioreaktoren nach Zugabe der nötigen protektiven Stoffe direkt in flüssigen Stickstoff versenkt werden, so dass es zu einem sofortigem Erstarren aller Strukturen und der Einstellung aller biochemischen Prozesse kommt. Dabei kann enzymatischer Stress auf die Zellen vollständig vermieden werden, da diese adhärent auf den Microcarriern eingefroren werden, so dass die zellulären Eigenschaften wie Membranintegrität und Fokalkontakte nicht gestört werden.

Zusätzlich können die Zellen nach dem Auftauen direkt wieder die Zellteilungs- und Stoffwechselvorgänge beginnen, ohne zuerst den komplexen Adhäsionsprozess durchführen zu müssen. Der modifizierte „Hängende Tropfen“ bietet hervorragende Möglichkeiten, Plattformen zur Optimierung von Protokollen zur Kultivierung, Differenzierung und Kryokonservierung zu entwickeln und damit endlich zu einer systematischen Entwicklung von Kulturmedien und Kulturbedingungen zu kommen.

 

Literatur

[1] www.hyperlab.eu

[2] Schulz, J. C., P. S. Stumpf, A. Katsen-Globa, A. Sachinidis, J. Hescheler and H. Zimmermann (2012). Engineering in Life Sciences, DOI: 10.1002/elsc.201100213.

[3] Beier, A.F., Schulz, J.C., Dörr, D., Katsen-Globa, A., Sachinidis, A., Hescheler, J. and Zimmermann, H. (2011). Cryobiology 63, 175-85.

[4] Zeisberger, S.M., Schulz, J.C., Mairhofer, M., Ponsaerts, P., Wouters, G., Doerr, D., Katsen-Globa, A., Ehrbar, M., Hescheler, J., Hoerstrup, S.P., Zisch, A.H., Kolbus, A. and Zimmermann, H. (2011). Cell Transplantation 20, 1241-57.

 

Korrespondenzadresse

Dr. Julia C. Schulz
julia.schulz[at]ibmt.fraunhofer.de

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Heft 3/2012

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