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Blitzlicht

Sensitive T-Zellantworten im RESTORE-System

Die Humanimmunologie ist auf die Untersuchung von Leukozyten aus dem peripheren Blut angewiesen. Dabei wird oft vergessen, dass insbesondere für T-Lymphozyten der ständige Zell-Zell-Kontakt im Gewebe für ihre Reaktionsbereitschaft wichtig ist. Ein Extrembeispiel ist der Zytokinsturm, der bei der klinischen Erprobung des CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpers TGN1412 in Probanden ausgelöst wurde, während menschliche mononukleäre Zellen (Lymphozyten plus Monozyten) aus dem venösen Blut in vitro keine Reaktion auf den löslichen Antikörper zeigen. Wir fanden, dass die während der Rezirkulation verlorengegangene TGN1412-Reaktivität durch kurzfristige Kultur bei hoher Zelldichte wiederhergestellt werden kann. Darüberhinaus werden aber auch die Antworten von CD4- („Helfer“-) und CD8- („Killer“-) T-Zellen auf virale, bakterielle und Tumorantigene in ihrer Sensitivität deutlich gesteigert. Somit eignet sich das RESTORE (von resetting T-cells to original reactivity)-Testsystem für ein hochempfindliches Immunomonitoring ebenso wie für eine verbesserte Abschätzung der Toxizität T-Zell-aktivierender Therapeutika.

Als im Jahr 2006 der monoklonale Antikörper TGN1412 in einer Phase I-Studie an freiwilligen Probanden getestet wurde, kam es zu einer unerwarteten lebensbedrohlichen Zytokinausschüttung1. Experimente an Nagetieren hatten zu der Erwartung geführt, dass CD28-spezifische monoklonale Antikörper mit hohem Aktivierungspotential (CD28-Superagonisten, CD28SA) wie TGN1412 vorwiegend regulatorische T-Lymphozyten aktivieren und somit anti-inflammatorisch wirken2.

Die unterschiedliche Reaktion von Nagern und Menschen ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die inzwischen als Quelle des Zytokinsturms beim Menschen identifizierten CD4-Effektor-Gedächtniszellen3, 4 in sauberen Labormäusen und -ratten kaum vorliegen. Auch das Ausbleiben einer toxischen Reaktion im präklinischen Modell für den menschlichen CD28SA TGN1412 selbst, dem Cynomolgus-Makaken, ist inzwischen verstanden: Im Gegensatz zum Menschen regulieren diese Primaten das Zielmolekül für den Antikörper, CD28, bei der Differenzierung von CD4-T-Zellen zu Effektor-Gedächtniszellen herunter, so dass kein Angriffspunkt für das Medikament vorliegt3.

Merkwürdigerweise kann eine TGN1412-Reaktion jedoch auch beim Menschen nicht vorhergesagt werden, wenn konventionelle Kulturen von PBMC (mononukleäre Blutzellen des peripheren Blutes, die im wesentlichen aus Lymphozyten und Monozyten bestehen) mit löslichem TGN1412-Antikörper stimuliert werden5. Eine Zufallsbeobachtung führte auf die Spur dieses Defekts, der von genereller Bedeutung für die Verwendung von PBMC für immunologische Tests auf T-Zellreaktivität ist4

Aus logistischen Gründen wurde eine PBMC-Präparation im Dezember 2009 nicht sofort im Experiment eingesetzt, sondern zunächst ohne stimulierende Zutaten bei 10-fach erhöhter Zelldichte (107 an Stelle von 106 pro ml) zwei Tage in Standardmedium mit 10% menschlichem AB-Serum kultiviert. Überraschenderweise zeigten diese Zellen bei Stimulation mit TGN1412 eine deutliche Ausschüttung von TNFa (Abb. 1B) und anderen Zytokinen4, frische PBMC-Kulturen dagegen keine Antwort (Abb 1A, [4]). Nachdem dieser Befund zunächst anhand einer großen Zahl von unabhängigen PBMC-Präparationen bestätigt und auf ein breites Spektrum von Zytokinantworten sowie die T-Zellproliferation erweitert worden war, versuchten wir, den Grund für diesen dramatischen Zugewinn an Reaktivität zu verstehen.

Wir fanden heraus, dass eine hohe Zelldichte sowie die Anwesenheit von Monozyten während der zweitägigen Vorkultur notwendig waren, um anschließend TGN1412-Reaktivität der T-Zellen zu beobachten4. Dies führte zu der Hypothese, dass die T-Lymphozyten während des gewebsartigen Zustands der Vorkultur bei hoher Zelldichte durch Interaktionen mit den Monozyten ein „Priming“-Signal erhalten, das sie – ebenso wie die im Körper vorliegenden CD4-Effektor-Gedächtniszellen – in die Lage versetzt, auf TGN1412 zu reagieren. Die Entwicklung dieser Hypothese schloss auch zwei frühere Befunde mit ein: Die Reaktion auf CD28-Superagonisten ist strikt abhängig von der Anwesenheit des T-Zellantigenrezeptors, der bei Kontakt mit MHC-Molekülen schwache oder „tonische“ Signale generiert, die von der CD28-initiierten Signalkaskade amplifiziert werden6, 7.

Darüber hinaus war in Mäusen gezeigt worden, dass T-Zellen beim Übertritt vom Gewebe in die Zirkulation eben dieses tonische T-Zellrezeptorsignal verlieren8. Wir postulierten deshalb, dass das für die TGN1412-Reaktion essentielle tonische T-Zellrezeptorsignal während der Zirkulation im Blut verlorengeht, jedoch durch kurzzeitige Kultur der PBMC bei hoher Dichte wiederhergestellt werden kann (Abb. 2), und konnten eine Reihe von Ergebnissen erarbeiten, die dieses Szenario zwar nicht endgültig beweisen, es jedoch sehr wahrscheinlich machen4.

Wie sieht es nun mit Antigen-spezifischen T-Zellreaktionen aus? Die Gruppe von Ron Germain am NIH konnte schon 2002 im Maussystem zeigen, dass die Reaktivität zirkulierender T-Zellen auf ein MHC II-präsentiertes Peptidantigen etwa 10-fach weniger sensitiv ist als die Reaktion von T-Zellen, die aus den Lymphknoten der gleichen Mäuse präpariert wurden8. Die im Zell-Zell-Kontakt erworbene Sensibilisierung bereitet offenbar die Signaltransduktionsmaschinerie der T-Lymphozyten darauf vor, bei Erkennung des „kognaten“ Peptidantigens rasch und effizient zu reagieren – angesichts der oft verschwindend geringen Zahl kognater MHC/Peptidkomplexe auf den Zielzellen ein sinnvoller Mechanismus.

Wir testeten deshalb nach Optimierung der Bedingungen während der Vorkultur bei hoher Zelldichte (siehe „Das optimierte RESTORE-Protokoll”) mit Hilfe von TGN1412 auch die Reaktion auf Recallantigene (Diphterie/Tetanus), ein bakterielles Superantigen sowie für virale und Tumor-abgeleitete Peptidantigene, die von CD8-Killer-T-Zellen erkannt werden. Wie die Beispiele in Abbildung 1 C und D zeigen, ermöglicht die Anwendung dieses optimierten Protokolls eine deutliche, oft mindestens 10-fache Steigerung der Sensitivität der T-Zellantworten. 

Wir sind überzeugt, dass dieser robuste und einfache Ansatz ein besseres Bild davon liefert, wie die 99% unserer T-Lymphozyten, die sich in den Geweben befinden, auf Antigene oder andere aktivierende Substanzen reagieren. Der „RESTORE“-Ansatz könnte dazu beitragen, das Immun-Monitoring bei Vakzinierungen und in Tumorpatienten zu verbessern sowie die Identifizierung Tumor-spezifischer Antigene zu erleichtern. Er ist jedoch auch für die Abschätzung des toxischen Potentials aktivierender monoklonaler Antikörper von großem Nutzen.

Hier kann als alternative Strategie zwar auch die Immobilisierung dieser Antikörper auf der Plastikoberfläche verwendet werden, um schon von frisch gewonnenen PBMC durch ein „superstarkes“ Signal Zytokinantworten zu erhalten9. Allerdings wird bei dieser Vorgehensweise nicht nur ein völlig anderes Stimulans angeboten, als es bei der Injektion eines löslichen Antikörpers vorliegt – sie erlaubt auch keine pharmakodynamischen Untersuchungen im Sinne der Korrelation von Dosis-Wirkungskurven und Rezeptorbesetzung.

Das optimierte RESTORE-Protokoll

l Kultur von frisch präparierten PBMC für zwei Tage in Standardmedium mit 10% menschlichem AB-Serum (oder auch in vollsynthetischem Medium) bei einer Zelldichte von 107 Zellen pro ml (2x106/cm2)

l Ernten der PBMC aus Suspensions-Kulturplatte und Aufbewahrung der PBMC bis zur Durchführung des Standard-PBMC-Tests auf Eis

l Einstellen der Zelldichte für einen Standard-PBMC-Test (106 Zellen/ml, 2x105/cm2)

l Einsetzen des monoklonalen Antikörpers TGN1412 als Positivkontrolle.

Die Erhöhung der Sensitivität der T-Zellantworten ist abhängig vom Zell-Zell-Kontakt während der Vorkultur, also von gewebsähnlichen Kulturbedingungen.

Literatur

[1] Suntharalingam, G., Perry, M.R., Ward, S., et al., N. Engl. J. Med. 355 (2006), 1018-1028
[2] Gogivhvili, T., Langerhorst, D., Lühder, F., et al., PLOS ONE 4 (2009), e4643
[3] Eastwood, D., Findlay, L., Poole, S., et al., Br. J. Pharmacol. 161 (2010), 512-526
[4] Römer, P.S., Berr, S. Avota, E., et al., Blood 118 (2011), 6772-82
[5] Duff, G.W., et al., Norwich, UK: Stationary Office (2006)
[6] Dennehy, K.M., Elias, F., Na, S.Y., et al., J. Immunol. 178 (2007), 1363-1371
[7] Levin, S.E., Zhang, C., Kadlecek, T.A., et al., J. Biol. Chem. 283 (2008), 15419-15430
[8] Štefanová, I., Dorfman, J.R., Germain, R.N., Nature 420 (2002), 429-434
[9] Eastwood, D., Findlay, L., Poole, S., et al., Br. J. Pharmacol. 161 (2010), 512-526

Hinweis: Die Rechte für die kommerzielle Anwendung des RESTORE Protokolls liegen bei der Firma TheraMab LLC. Kontakt: Dr. Sergey Chuvpilo (chuvpilo[at]theramab.com).

Korrespondenzadresse

Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Thomas Hünig
Julius-Maximilians Universität Würzburg
Institut für Virologie und Immunbiologie
Versbacher Straße 7, 97078 Würzburg
Tel.: +49-(0)931-201-49951, Fax: -49243
huenig[at]vim.uni-wuerzburg.de

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