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Molekulare Angel für sekretierte Proteine

Ohne sekretierte Proteine gäbe es keine Zellkommunikation, doch war ihre Detektion bislang hochkompliziert. Insbesondere niedrig konzentrierte Signalmoleküle konnten bislang nicht nachgewiesen werden, weil sie in der Masse der hochabundanten Serumproteine des Zellkulturmediums schlichtweg nicht mehr zu sehen waren – zumindest nicht mit bisherigen Methoden der Proteomanalyse. 

Wer glaubt, die Kultivierung in Serum-freiem Medium sei der Ausweg, irrt. Denn unter Serummangel verändern sich sowohl der Phosphorylierungsstatus als auch das Expressionsmuster der Signalproteine. Forscher um Jeroen Krijgsveld vom Heidelberger EMBL haben jetzt ein Verfahren vorgestellt, das sowohl die Anreicherung der sekretierten Faktoren als auch ihre Quantifizierung ermöglicht. Durch den Einbau modifizierter Aminosäuren in die wachsenden Polypeptidketten kann die Bildung der Signalmoleküle zeitaufgelöst erfasst und quantifiziert werden.

Eichelbaum K, Winter M, Diaz MB, Herzig S, Krijgsveld J.(2012): Selective enrichment of newly synthesized proteins for quantitative secretome analysis, Nature Biotechnology 2012;30(10):984-90. doi:10.1038/nbt.2356 

LABORWELT:
Weshalb ist es so schwierig, sekretierte Proteine zu untersuchen?

Krijgsveld:
Die Mengen der sekretierten Proteine sind typischerweise sehr niedrig, und durch das Kulturmedium werden sie weiter verdünnt. Dazu kommt, dass Zellen oft in 10%-igem Serum kultiviert werden und die Konzentration an Serumproteinen dementsprechend sehr hoch ist. Meist liegt sie zwischen 5 mg/ml und 10 mg/ml. Dies maskiert die sekretierten Proteine noch einmal zusätzlich. Es ist nicht einfach, sie in diesem Hintergrund hochabundanter Serumproteine aufzuspüren. Um sekretierte Proteine zu detektieren, wurden bislang hauptsächlich zwei Ansätze verfolgt: Kultur in serumfreiem Medium, gefolgt von Proteom-Profiling – allerdings verändert der Serummangel das Expressions- und Phosphorylierungsmuster der Proteine. Alternativ wurden die Zellen in serumhaltigem Medium kultiviert und anschließend eine extensive Protein- beziehungsweise Peptidfraktionierung durchgeführt. Dabei konnten gerade die niedrig abundanten Proteine oft nicht detektiert werden.

LABORWELT:
Was haben Sie getan, um das Problem zu lösen?

Krijgsveld:
Wir haben ein neues Verfahren entwickelt, das neu gebildete, sekretierte Proteine selektiv anreichert. Der Trick dabei ist, die sekretierten Proteine aus dem serumhaltigen Medium einzufangen. Wir haben das erreicht, indem wir dem Medium die nicht-natürliche Aminosäure Azidohomoalanin zugefügt haben, so dass sie in neugebildete Proteine eingebaut wird. Sie enthält eine Azid-Gruppe und lässt sich dadurch kovalent an Alkyn-aktivierte Harze binden, ermöglicht also eine Affinitätsaufreinigung. Die so angereicherten Proteine lassen sich dann von den Beads eluieren oder mit Proteasen verdauen und anschließend massenspektrometrisch untersuchen. Zusätzlich können wir die Proteine quantifizieren. Wir bieten dazu, gleichzeitig zum Azidohomoalanin, mit stabilen Isotopen markierte Aminosäuren an und können dann mittels der etablierten SILAC-Methode die relativen Mengen neugebildeter Proteine bestimmen. Die Kombination beider Verfahren ermöglicht die Quantifizierung der sekretierten Proteine. Dies können wir nutzen, um zum Beispiel die zeitliche Veränderung ihrer Sekretion nach einem Reiz zu untersuchen.

LABORWELT:
Wie haben Sie Ihren Ansatz validiert?

Krijgsveld:
Wir haben uns bereits etablierte, in der Literatur beschriebene Systeme genommen und geschaut, welche Ergebnisse wir mit unserer neuen Methoden erhalten. Dazu zählten Makrophagen, die wir mit bakteriellen LPS-Antigenen stimuliert haben, um eine Reaktion des angeborenen Immunsystems zu induzieren. Es sind eine Reihe von Effektoren bekannt, die im Zuge dieser Antwort sekretiert werden, und wir haben sie alle gefunden. Darüber hinaus fanden wir aber auch neue, bisher nicht bekannte Proteine. Damit haben wir das Verfahren auf Basis von Daten, die in der Literatur beschrieben sind, validiert.

LABORWELT:
Wo und wie lässt sich Ihre Methode denn an­wenden?

Krijgsveld:
Es gibt zahlreiche Anwendungen. Nehmen Sie zum Beispiel in vitro-Assays, um die Mechanismen der Zellaktivierung zu untersuchen, zum Beispiel durch Wachstumsfaktoren oder Zytokine. Das Verfahren lässt sich aber genauso gut zum Screening von Arzneimittelkandidaten oder Inhibitoren einsetzen. Wir selbst planen, damit Zellen in Kokultur zu untersuchen. Bisher hat man sich meist einzelne Zellkulturen angesehen. Aber in der Natur kommen Zellen nie isoliert vor, und es gibt eine rege Zellkommunikation unter den verschiedenen Zelltypen. Und wir haben nun ein Tool, um diese Signale zu untersuchen. Das bietet sowohl in der Grundlagen- als auch in der Industrieforschung neue Möglichkeiten.

LABORWELT:
Wie ließe sich Ihr Verfahren denn kommerzialisieren?

Krijgsveld:
Alle Einzelbestandteile waren bereits vorhanden. Wir haben sie nur neu kombiniert, um sie für Sekretomanalysen nutzen zu können. Die Methode an sich ist also nicht patentierbar, die Anwendungen schon. Wir sprechen bereits mit Industriepartnern darüber, die Methode in verschiedensten Anwendungsgebieten gemeinsam zu entwickeln. Unser Forschungsinteresse liegt dabei u. a. auf Anwendungen in der Krebsdiagnostik.

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Heft 4/2012

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http://www.laborwelt.de/spezialthemen/bioanalytik/sekretierte-proteine.html

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