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Nanoporen-gestützte Analytik auf Arrays

Porenbildende Membranproteine, sogenannte biologische Nanoporen, wie a-Hämolysin oder das Porin A von Mycobacterium smegmatis (MspA), spielen eine zunehmend wichtige Rolle als Werkzeuge der Bioanalytik. Über die Blockade des Ionenstroms durch die wenige Nanometer großen Membranporen können einzelne, ins Innere der Pore diffundierende oder migrierende Moleküle detektiert und zum Beispiel ihre Größe oder ihr Bindungsverhalten bestimmt werden (molekularer Coulter-counter). Neben der vieldiskutierten Anwendung zur DNA-Sequenzierung sind viele weitere Anwendungsmöglichkeiten – von der Massenspektrometrie von Polymeren bis hin zur Detektion von microRNAs oder dem Aptamer-vermittelte Nachweis kleiner Moleküle – gezeigt worden. Diesem neuen und vielversprechenden bioanalytischen Prinzip fehlt allerdings bisher eine Hochdurchsatz-geeignete Plattform.

Diese Plattform muss zwei Anforderungen erfüllen: 1. Präzise Messung des Ionenstroms in einem hochintegrierbaren Format und 2. automatisierte und verlässliche Herstellung der für die Rekonstitution der Porenproteine und für die Messung erforderlichen, freistehenden synthetischen Lipidmembranen (Black Lipid Membranes, BLM). Mikrokavitäten mit langzeitstabilen, integrierten Ag/AgCl-Mikroelektroden (microelectrode cavity array, MECA) sollen hier in Kombination mit speziell für diese Plattform entwickelten Verfahren zur automatischen Herstellung von BLMs den Durchbruch ermöglichen.

Messtechnisches Grundprinzip der Messung von Ionenströmen ist die „Spannungsklemme“ (voltage clamp). Durch einen potentiostatischen Rückkopplungsverstärker (s. Abb. 1A) wird die Spannung über eine von beiden Seiten mit Elektrolytlösung in Kontakt stehende isolierende Grenzschicht oder Membran konstant gehalten. Kommt es durch eine Pore oder einen Ionenkanal in der Membran zur Bewegung von Ionen, also zum Ladungstransport, liefert die elektronische Schaltung gerade den Strom, der zur Aufrechterhaltung eines konstanten Potentials notwendig ist (Spannungsklemme). Dieser Ausgleichsstrom, der dem Betrag nach gerade gleich dem Ionenstrom ist, der über die Membran fließt, wird gemessen. 

Sowohl für eine hohe Präzision (geringes Messrauschen) als auch für einen hohen Durchsatz der Spannungsklemm-Messungen ist es wünschenswert, solche Messungen in mikrostrukturierten Array-Formaten durchzuführen. Je kleiner die Abmessungen der Membranen sowie der elektrolytgefüllten Kompartimente desto geringer ist die kapazitive Last am Verstärkereingang – und damit das elektrische Messrauschen – und desto mehr solcher Messan-ordnungen lassen sich in Form eines Arrays auf kleiner Fläche unterbringen. Eine hohe Dichte solcher Anordnungen ermöglicht mit Mehrkanalverstärkern gleichzeitige Messungen und ist Voraussetzung für Hochdurchsatz.

Der Microelectrode Cavity Array (MECA)

Die Spannungsklemm-Technik erfordert die präzise Messung des elektrischen Potentials über die Membran und effizienten Ladungstransport zur Injektion des Ausgleichsstroms. Dies setzt den Einsatz von sogenannten reversiblen Elektroden 2. Art, zum Beispiel Silber/Silberchlorid- (Ag/AgCl) oder Kalomelelektroden (Hg2/Hg2Cl2) voraus. An solchen Redox-Elektroden können durch Reduktions- und Oxidationsreaktionen Ladungen vom Metall in die Lösung übergehen. Inerte Metallelektroden aus Gold oder Platin haben in physiologischen Salzlösungen kein konstantes Potential und sind nicht geeignet, den stabilen Übergang von Elektronenleitung (im Metall) zu Ionenleitung (in der Salzlösung) zu gewährleisten. 

Typischerweise handelt es sich bei den verwendeten Elektroden um mit Silberchlorid beschichtete Silberdrähte mit Dicken zwischen 0,5 und 2 mm. In Array-Formaten sind relativ große, elektrolytgefüllte Räume, wie etwa fluidische Kanäle, notwendig, um diese makroskopischen Elektroden individuell in elektrischen Kontakt der Membran zu bringen. Zusätzlich bedingt die große, von Flüssigkeit benetzte Fläche eine hohe elektrische Kapazität des Gesamtsystems, die sich über das kapazitive Stromrauschen negativ auf die Messgenauigkeit auswirkt.

Bisher gibt es eine Anzahl unterschiedlicher Ansätze, die die Herstellung von BLM-Arrays zum Ziel haben. Dabei ist allen Ansätzen gemein, dass sie von beidseitig makroskopischen Elektroden ausgehen, was die Integrationsdichte auf Abstände von mehreren mm zwischen den Messpositionen limitiert. Zusammen mit meist sehr großen (Durchmesser > 50 µm) Bilipidschichten bedingt dies auch hohes kapazitives Rauschen und geringe Messauflösung.

Die MECA-Technologie (Abb. 1) zeichnet sich gegenüber dem Stand der Technik durch die extrem miniaturisierte Ausführung der mit dem Verstärkereingang verbundenen Elektrode aus. Diese Mikroelektrode mit einem Durchmesser von 10-50 µm bildet den Boden einer Mikrokavität (Volumen < 1 pL) und wird über coplanare mikroskopische Goldleiterbahnen kontaktiert. Diese Mikroelektrodenkavitäten können im Abstand von 200 µm zueinander angeordnet werden (Micro Electrode Cavity Array). Dadurch wird erstmals die Bildung dichter (>10/mm2) Arrays ermöglicht, die für hochauflösende elektrische Messungen schädliche Streukapazität minimiert sowie die Herstellung vereinfacht. Mit bisher zwei nach diesem extrem vereinfachten Ansatz hergestellten Prototypen haben wir bereits routinemäßig stabile und hochpräzise parallele BLM-Messungen an bis zu 16 Messpunkten (Abb. 2B-3) gezeigt. Dabei diente ein besonders anspruchsvoller Nanoporen-Assay (Polymermassenspektroskopie mit Auflösung einzelner Monomere) als Benchmark-Test, den der Prototyp erfolgreich absolvierte (Abb. 1B)..

Automatisierte Herstellung von Bilipidschichten

Meist werden synthetische Bilipdschichten mit Hilfe von hydrophob beschichteten Drahtschlingen oder sich zur Spitze hin verjüngenden Stäben oder Folien aus hydrophobem Material, insbesondere Teflon, hergestellt. Mit diesen Gerätschaften werden Phospholipide in Lösungsmittel auf eine Apertur aufgebracht und solange mechanisch über die Apertur bewegt, bis es zum elektrisch dichten Verschluss und zur Bildung einer bimolekularen Bilipidschicht durch allmähliches Ausdünnen der Lipidphase kommt. Weil die Bewegung der Lipidlösung dabei dem Versteichen von Farbe mit Pinselstrichen ähnelt, wird diese Methode als „Painting“ bezeichnet. Neben diesem Painting-Verfahren existiert noch das Müller-Montal-Verfahren, bei dem eine Lipid-Monolage an einer Luft-Wasser-Grenzschicht über eine Apertur bewegt wird. Insgesamt sind diese Verfahren nicht nur schlecht zu automatisieren, sondern auch wenig verlässlich.

Für die Anwendung mit der MECA-Technologie konnten neue Verfahren zur automatischen Erzeugung von BLMs erarbeitet und zum Patent angemeldet werden, von denen hier nur das besonders erfolgreiche Ionera-SPREAD-Verfahren (Abb. 2A) besprochen wird. Bisherige Versuche, horizontale Bilipidschichten auf planaren Trägern automatisiert herzustellen sind immer von mikrofluidischer Bewegung der Lipidlösung ausgegangen. Das direkte lokale Bewegen der Lipidlösung mit Hilfe eines berührungsfrei gesteuerten Effektors (Abb. 2A) ist bisher unseres Wissens nach nicht versucht worden, bedeutet aber eine massive konstruktive Vereinfachung gegenüber allen bisherigen Methoden.

Entscheidend für die gegenüber der manuellen Methode auf praktisch 100% gesteigerte Erfolgsrate ist wahrscheinlich die definierte und gleichförmige Bewegung des Lipids durch die Bewegung des hydrophoben mechanischen Effektors sowie die Tatsache, dass die Lipidlösung durch die Drehbewegung zwischen zwei ähnlich hydrophoben Oberflächen (hier SU8 und PTFE) in idealer Weise gespreitet wird.

Die durch dieses Verfahren mögliche, verlässliche Ausbildung von Bilipidschichten im Arrayformat stellt einen entscheidenden technischen Durchbruch dar, ohne den BLM-Arrays im industriellen Kontext nicht einsetzbar wären. Die Nanion Technologies GmbH, München, hat kürzlich ein erstes Tischgerät zur Messung an BLM-Arrays (Orbit-16) vorgestellt, für das auch ein Modul entwickelt wurde, das den 16-Kanal-MECA-Chip aufnimmt und die automatisierte Herstellung der BLMs „auf Knopfdruck“ leistet.

Ausblick

Auf der Grundlage dieser Entwicklungen bereitet eine durch das EXIST-Programm des Bundesministeriums für Wirtschaft und Technologie geförderte Arbeitsgruppe die Ausgründung eines Start-up-Unternehmens unter dem Namen Ionera vor. Ziel des Projekts Ionera (www.ionera.de) ist die Entwicklung der MECA-Technologie zur Martkreife. Die strukturell radikal vereinfachte MECA-Plattform soll zusammen mit den Verfahren für die automatische Erzeugung von BLM-Arrays die gegenwärtig verwendeten Verfahren zur bioelektrischen Analyse mit Hilfe von biologischen Nanoporen mit großem Kundennutzen bezüglich Präzision, Informationsgehalt, Zeitaufwand und Kosten ersetzen. Das zu gründende Unternehmen wird als OEM-Hersteller von Mikrochips und Testkits maßgeschneiderte Lösungen für verschiedenste Anwendungen anbieten, um mit Hilfe der MECA-Technologie das Potential der biologischen Nanoporen für die biologische und chemische Analytik in seiner gesamten Breite zu realisieren. 

Literatur

[1] Gracheva, E. (Hrsg.) Nanopore-based technology (Methods in Molecular Biology 870) Springer, New York, 2012 
[2] Übersicht bei: Demarche et al. Analyst 6, 1077, 2011, Zagnoni, M. Lab on a Chip, 12, 1026, 2012
[3] Baaken, G. et al. ACS Nano, 2011, 5, 8080–8088; G. Baaken, J. C. Behrends, BIO-Spektrum, 2011, 17, 769-772
[4] Mueller, P. et al., Z. Kreislaufforschung, 1963, 52 (7) 534.
[5] Montal, M.; Mueller, P., Proceedings of the National Academy of Sciences, 1972 69, (12), 3561-3566
[6] White, S.H. In: Miller, C. (Hrsg.) Ion Channel Reconstitution, p. 3-35, Plenum, New York (1986)

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Jan C. Behrends
jan.behrends[at]uni-freiburg.de

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