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Biosensorik- und PCR-Innovationen

Fortschritte in der Messtechnik haben stets Paradigmenwechsel in der Biologie begleitet oder waren ihre Voraussetzung. Neue Verfahren ermöglichen künftig die parallele Sequenz- und Arrayanalyse derselben Probe sowie eine Point-of-need-Diagnostik von Pathogenen.

Günter Roth

LABORWELT:

Wie kann die digitale PCR eingesetzt werden, um zugleich Sequenzierungen und Microarray­analysen zu ermöglichen?

Roth:

Bei einer digitalen PCR (dPCR) werden die Volumina pro Reaktion so weit verkleinert, dass entweder kein (entspricht einer Null) oder ein (entspricht einer Eins) DNA-Strang im Reaktionsvolumen verbleibt. Nach der dPCR werden die positiven und die negativen Reaktionen gezählt und damit die Konzentration der DNA bestimmt. Für Sequenzierungen wird oft eine spezielle Form der dPCR verwendet: die Emulsions-PCR. Diese Emulsion wird aus PCR-Mix, DNA, Sequenzierbeads und Öl erzeugt. Idealerweise erhält man dann pro Reaktionsvolumen genau einen DNA-Strang und genau ein Sequenzierbead. In der folgenden PCR wird der DNA-Strang amplifiziert und auf dem Sequenzierbead immobilisiert. Einige Next Generation Sequencing-Plattformen nutzen nun diese DNA-beladenen Beads, um sie in kleinen Kavitäten (Wells) eines Sequenzierchips abzulegen. Pro Well wird maximal ein Bead abgelegt und damit pro Well eine DNA-Sequenz ermittelt. Ein Sequenzierchip kann dabei Millionen von Wells enthalten und die Sequenzierung kompletter Genome ermöglichen.

Betrachtet man diese Sequenzierchips genauer, so stellt man fest, dass das Volumen eines Wells nur wenige Pikoliter beträgt – geradezu ideal für eine dPCR. In einem neuen Verfahren ist es uns nun gelungen, parallel in mehr als 100.000 Wells eines Sequenzier­chips eine dPCR durchzuführen. Hierzu wird der Sequenzierchip mit einem DNA-haltigen PCR-Mix befüllt und mit einem Deckel so versiegelt, dass jedes Well ein abgeschlossenes Reaktionsvolumen bildet. Gemäß des digitalen Ansatzes befindet sich dann pro Well ein oder kein DNA-Strang.

Sowohl der Deckel als auch der Sequenzierchip sind so präpariert, dass in der dPCR die DNA auf den jeweiligen Oberflächen immobilisiert wird. Man „kopiert“ sozusagen die DNA in einem einzigen Schritt in den Sequenzierchip und auf den Deckel. Jedes Well mit einer DNA generiert dabei einen Spot auf dem Deckel. Der Deckel trägt somit ein DNA-Microarray, welches eine Kopie des nun DNA-beladenen Sequenzierchips darstellt. 

Es bleibt zu zeigen, ob solch ein DNA-beladener Sequenzierchip in einer Standard-Sequenzierung verwendet und sequenziert werden kann. Sicher ist, dass eine dPCR in einem Sequenzierchip die bisherige aufwendige Emulsions-PCR komplett umgeht und zudem längere DNA-Sequenzen als bisher erlaubt. Potentiell könnte so bei jeder Sequenzierung eine DNA-Microarray-Kopie mitgefertigt werden – ein DNA-Microarray mit bis zu 1.500 bp langen DNA-Sonden und (potentiell) einem kompletten Genom.

  

Dr. Günter Roth
Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK), Freiburg

Frank Bier

LABORWELT:

Welche Fortschritte gibt es auf dem Gebiet der farbgekoppelten PoC-Diagnostik zum Nachweis von Pathogenen?

Bier:

Der Nachweis von Erregern im Rahmen der medizinischen Diagnostik ist immer noch auf spezialisierte Laboratorien angewiesen. Anzucht und Identifizierung der Keime oder Präparation und Nachweis mittels PCR dauern oft zu lange, so dass häufig „auf Verdacht“ mit Antibiotika therapiert wird, die nicht zur Infektion passen. Dies hat nicht zuletzt zur Ausbildung und Verbreitung von Antibiotikaresistenzen geführt, die heute ein großes therapeutisches Problem darstellen. 

In einem vom Fraunhofer-IBMT und der Universität Potsdam koordinierten und vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Projekt „Das Taschentuchlabor – Impulszentrum für integrierte Bioanalyse“, an dem mehr als 30 Projektpartner aus 14 Institutionen  beteiligt sind, werden daher molekulare Nachweissysteme erforscht und entwickelt, die wie das Immunsystem unmittelbar auf Erreger reagieren sollen. 

Solche sogenannten Sensor-Aktor-Moleküle könnten auch in Gegenstände des täglichen Bedarfs, wie etwa Hygienetücher, integriert werden und ohne Laborgeräte den Erregernachweis am „Point-of-need“ ermöglichen. Im Zentrum der Forschung stehen die Generierung von hoch-funktionalen, von Antikörpern abgeleiteten Erkennungsstrukturen, die Kopplung dieser Strukturen an flexible Oberflächen auf Basis funktionalisierter Hydrogele und die Erzeugung eines spezifischen, schnellen und direkt erkennbaren Signals. 

Für die Erkennungsstrukturen wurden für Influenza, MRSA, Salmonella und andere Erreger jeweils ein Epitopmapping durchgeführt, um relevante Oberflächenstrukturen zu identifizieren. In einem anschließenden Paratopmapping wurden wiederum die an der Erkennung beteiligten Bereiche der Antikörper identifiziert, um diese an Hydrogele zu koppeln. Durch die räumlich definierte Anbindung dieser Strukturen wird es nun möglich, „Superantikörper“ zu generieren, die durch Erkennung mehrerer Epitope eines Erregers die Spezifität entsprechender Tests entscheidend verbessern sollen. 

Bindet ein Erreger an solche Strukturen, kollabiert das Hydrogel, an das diese gebunden sind. An diesen Materialien und ihrem Einsatz als „smart materials“ wird derzeit intensiv geforscht. Der Kollaps des Hydrogels soll dann zu einem Farbumschlag des Gels – durch eine Redox­reaktion oder auch durch Quenching – führen. „Das Taschentuchlabor“ stellt weltweit die einzige Initiative dar, in der die Polymerforschung mit den Life Sciences verbunden wird, um die molekulare Integration der Infektionsdiagnostik voranzutreiben. Das Projekt läuft bis Herbst 2014 – bis dahin werden erste Prototypen erwartet.

Dr. Frank Bier
Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik, Potsdam

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Heft 4/2012

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