Thema: Bioanalytik, Mess- und Regeltechnik

Blitzlicht

PCR einfach optimieren

Die Basenzusammensetzung und Länge bestimmen die Annealingtemperatur von PCR Primerpaaren. Es gibt eine ganze Reihe verschiedener Algorithmen zur Berechnung der Primer-Schmelztemperatur (Tm), die meistens jedoch zu unterschiedlichen Ergebnissen führen.

Die einfachsten Methoden sind die Formeln zur Berechnung der Primer-Schmelztemperatur Tm nach Marmur und Doty [1] oder Wallace et al. [2]. Bei diesen beiden Methoden werden weder die Salzkonzentration noch die Position der Nukleotide in der Primersequenz beachtet. Sie sollten daher nicht für Sequenzen mit mehr als 14 Nukleotiden verwendet werden beziehungsweise ergeben sie zweifelhafte Resultate für längere Primer. Tm-Berechnungsmethoden inklusive Korrekturfunktion für die Salzkonzentration sind für lange Sequenzen besser geeignet [3]. Die besten Methoden zur Berechnung von Primer Tm–Werten sind sogenannte Base-Stacking-Algorithmen [4, 5, 6]. Sie beruhen auf dem Nearest-Neighbor-Algorithmus und berechnen den Primer-Tm-Wert ausgehend von der Salzkonzentration  und der Nukleotidposition in der Sequenz.

Linear Gradient Tool

Durch Verwendung der Gradientenfunktion des PCR Thermocyclers TAdvanced lässt sich die optimale Primer-Annealingtemperatur (Ta) experimentell ermitteln, die dann als ganzzahliger Temperaturwert (Ta-Wert) in Routine-PCR-Protokolle übertragen wird.
Traditionell werden Gradienten programmiert, indem Temperaturwerte für die linke und rechte Seite des Probenblocks eingegeben werden (zum Beispiel 55° C bis 65° C). Bedingt durch technische Gründe hat der Temperaturgradient bei den meisten PCR-Instrumenten allerdings einen sigmoiden Verlauf, was bedeutet, dass die Temperaturdifferenz zwischen den Spalten beziehungsweise Reihen des Probenblocks unterschiedlich groß ist. Der traditionelle Weg der Gradientenprogrammierung und die verschieden großen Temperaturdifferenzen zwischen den Spalten beziehungsweise Reihen des Probenblocks führen zu Nachteilen, wenn versucht wird, die optimale Primer-Annealingtemperatur exakt zu bestimmen:

  • In den Spalten oder Reihen des Probenblocks treten nicht-ganzzahlige Temperaturwerte auf.
  • Temperaturunterschiede zwischen den Reihen oder Spalten sind ungleich und vergrößern sich zur Mitte des Probenblocks hin.
  • Es ist unmöglich, den berechneten Ta-Wert für die Gradientenprogrammierung direkt zu nutzen.

Die erwähnten Nachteile treten unter Verwendung des Biometra Linear Gradient Tools nicht auf. Das Linear Gradient Tool erlaubt die Programmierung eines Temperaturgradienten ausgehend vom berechneten Ta-Wert mit definierten Temperaturabständen (Inkrement) zwischen den Spalten des Probenblocks. Zum Beispiel kann eine berechnete Primer-Annea­lingtemperatur (Ta) von 60° C für Spalte 6 des 96-Well-Probenblocks programmiert und die Temperaturdifferenz zwischen den Spalten den Probenblocks auf ±1.0° C gesetzt werden. Für den 96-Well-Probenblock stehen insgesamt 12 Spalten (Temperaturen) zur Verfügung.

Zusammenfassung

Das Biometra Linear Gradient Tool des TAdvanced Thermocyclers ist ein nützliches Hilfsmittel, um die optimale Primer-Annea­lingtemperatur (Ta) in einem einzigen PCR-Experiment zu ermitteln. Es erlaubt die Eingabe der berechneten Primer-Annealingtemperatur und davon ausgehend die Festlegung eines Temperaturinkrements. Mittels des Linear Gradient Tools ist es einfach, Gradienten mit geradzahligen Temperaturen und mit gleichen Temperaturabständen von Spalte zu Spalte einzustellen. Die Ergebnisse lassen sich so ohne Probleme in ein Standard-PCR-Protokoll ohne Gradienten übertragen. Daher spart das Linear Gradient Tool Zeit und Aufwand, wenn neue Primerpaare optimiert werden sollen.

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2/2015

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