Thema: Bioanalytik, Mess- und Regeltechnik

Blitzlicht

Leistungssteigerung bei der Massenspektrometrie

Massenspektrometrie und Ionenmobilitätsspektrometrie sind ähnlich alte Techniken, die in der Geschichte der Analytik eine lange Koexistenz haben. Inzwischen gibt es Hybridgeräte, die beide Methoden verlustfrei und routinetauglich in einem Gerät kombinieren. 

Die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) ist eine der Massenspektrometrie sehr ähnliche Technik, nur dass hier Ionen nicht im Vakuum und aufgrund ihres Masse/Ladungsverhältnisses, sondern durch unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit in einem Gas getrennt werden. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt dabei neben der Ladung vom Querschnitt des Volumens ab, welches sich bei freier Drehung der Ionen ergibt, und als Collisional Cross Section bezeichnet wird. Somit können mittels IMS zum Beispiel auch Ionen mit gleichem Masse/Ladungsverhältnis getrennt werden, wenn sie durch ihre unterschiedliche räumliche Struktur verschiedene Collisional Cross Sections haben.
Massenspektrometrie und Ionenmobilitätsspektrometrie sind ähnlich alte Techniken, die in der Geschichte der Analytik eine lange Koexistenz haben. Der Einbau einer Ionenmobilitätszelle in ein kommerzielles hochauflösendes Massenspektrometer ist jedoch mit technischen Schwierigkeiten verbunden, welche die Einführung von Hybrid-Geräten verzögerten. Durch Travelling Wave Ionenmobilitätsspektrometrie (TWIMS) können diese überwunden werden. 2006 konnte durch die Vorstellung des SynaptTM (Waters) gezeigt werden, dass es technisch möglich ist, TWIMS und hochauflösende Time-of-Flight-Massenspektrometrie (TOF-MS) verlustfrei und routinetauglich in einem Gerät zu kombinieren.

Ein Schema des Models Synapt G2-Si ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei dem Gerät handelt sich um ein sogenanntes Quadrupol-oaTOF Hybridmassenspektrometer (Q-TOF-MS) bei dem die übliche Kollisionszelle durch eine Triwave-Zelle ersetzt ist. In dieser flankieren zwei Travelling Wave Kollisionszellen (Trap- und Transfer-Kollisionszelle) eine Travelling Wave Ionenmobilitätszelle. Somit ist es möglich, Fragment-Ionen zu erzeugen und diese vor der massenspektrometrischen Analyse im TOF mittels IMS zu trennen, es können aber auch IMS-getrennte Ionen fragmentiert werden. Nach Verlassen der Triwave-Zelle werden die Ionen zum aoTOF-Analysator weitergeleitet. Dort wird ihre Ankunftszeit, welche sich im wesentlichen durch die Zeit in der TWIMS-Zelle ergibt, und ihre masseabhängige Flugzeit im TOF bestimmt. Dabei erhält man für jedes detektierte Ion neben der Massen-Information eine IMS-Driftzeit-Information und damit eine zusätzliche Dimension von Daten. Durch die zeitliche und räumliche Trennung der Ionen in der TWIMS-Zelle können massenspektrometrische Techniken wesentlich in ihrer Leistung gesteigert werden.

Im Jahr 2004 wurde mit LC-MSE erstmals ein Data Independent Acquisiton (DIA)-Experiment als kommerzielle LC-MS-Technik vorgestellt. Im Gegensatz zur Data Dependent Acquisition (DDA), bei der in einem MSMS-Experiment mit einem MS1-Filter einzelne Ionen selektiert und anschließend fragmentiert werden, handelt es sich bei LC-MSE um ein multiplexed LC-MS-Experiment. Alle Ionen, die in der Ionenquelle des Massenspektrometers gebildet werden, werden auch fragmentiert. Durch alternierendes Ein- und Ausschalten der Kollisionsenergie erhält man einen vollständigen Datensatz aller erzeugten Ionen und aller daraus generierbaren Fragment-Ionen. Der Vorteil eines solchen Datensatzes ist, dass auch bei Analysen, bei denen man vorher nicht alle erwarteten Analyten kennt, keine Gefahr für Informationsverluste besteht.

Analyse komplexer Datensätze

Die Herausforderung bei der Analyse der LC-MSE-Daten besteht in der hohen Komplexität des erzeugten Datensatzes. Wenn beispielsweise zwei Vorläufer-Ionen gleichzeitig von der LC eluieren, dann mischen sich auch ihre Fragment-Ionen im Massenspektrum. Begegnen kann man dieser Herausforderung zunächst mit hoher Auflösung der chromatographischen Trennung und einem sogenannten Chromatographic Cleaning. Da Fragment-Ionen aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit von Gasphasen-Fragmentierungen in einem Massenspektrometer stets exakt das gleiche LC-chromatographische Profil wie ihre Vorläufer-Ionen aufweisen, können bereits bei geringsten Abweichungen im LC-Profil zweier Vorläufer-Ionen die Fragment-Ionen eindeutig zugeordnet werden. Hier treten bei komplexen Mischungen die hohen Peak-Kapazitäten moderner UPLC-Trennverfahren als großer Vorteil hervor. Dennoch lassen sich bei der enormen Komplexität, die zum Beispiel in einem Shotgun-Proteomics-Experiment auftritt, niemals alle Vorläufer-Ionen LC-chromatographisch unterscheiden. In diesen Fällen kann die zusätzliche Ionenmobilitäts-chromatographische Trennung helfen. Bei Fragmentierung der Vorläufer-Ionen in der Transfer-Kollisionszelle nach Ionenmobilitätstrennung in der TWIMS-Zelle, haben wiederum alle Fragment-Ionen exakt das gleiche IMS-chromatographische Profil wie ihre Vorläufer-Ionen. Damit lässt sich ein Fragment-Ion eindeutig nur einem Vorläufer zuordnen, der das gleiche LC-chromatographische Profil und das gleiche IMS-chromatographische Profil aufweist wie es selbst (Abbildung 2).

Die Analyse mittels HDMSE führt gegenüber dem LC-MSE-Experiment zu einer wesentlichen Steigerung der Spezifität und damit zu einer Leistungssteigerung der Methodik, mit der zum Beispiel im Shotgun Proteomics-Experiment etwa eine Verdopplung der identifizierbaren Proteine bei sonst identischen Parametern beobachtet werden kann. Eine umfassende Darstellung der Leistungsfähigkeit von HDMSE findet sich in Distler et al.


TWIMS-gestütztes DDA (HD-DDA)

Die bereits erwähnte Data-Dependent-Acquisition-Strategie ist eine sehr gute Methode bei der LC-MS-Datenaufnahme erwarteter Analyten in gezielten Experimenten und auch bei einigen Formen von ungezielten Experimenten noch immer unumgänglich. Vorteil der Methode ist, dass alle nicht interessierenden Vorläufer-Ionen bereits mit dem MS1-Filter entfernt werden. Somit sind die Fragmentspektren wesentlich weniger komplex. In hochkomplexen Analysen besteht die Herausforderung beim DDA-Experiment in einem Zeitproblem. Da während der Auswahl eines Vorläufers alle anderen Signale ausgefiltert werden, muss die Datenaufnahmezeit so gering wie möglich gehalten werden, um möglichst viele Vorläufer auswählen zu können.

Mit immer geringeren Aufnahmezeiten sinken aber die Signalintensitäten insbesondere der Fragmentspektren unter die Nachweisgrenze. Damit resultiert aus dem Zeitproblem ein Empfindlichkeitsproblem, welches sich nur durch höchstmögliche MSMS-Empfindlichkeit lösen lässt. Bei modernen hochauflösenden Massenspektrometern sind die technischen Optimierungsmöglichkeiten bezüglich der Empfindlichkeit bereits stark ausgeschöpft. Ein Punkt mit dennoch hohem Optimierungspotential für die Empfindlichkeit von oaTOF-Massenspektrometern ist die orthogonale Ablenkung der Ionen. Am dafür zuständigen Pusher kommt ein kontinuierlicher Ionenstrom an. Von diesem werden Pakete in das TOF-Flugrohr abgelenkt. Alle Ionen, die während der Flugzeit eines Paketes am Pusher ankommen, gehen verloren (Abb. 3A).

Der typische Duty Cycle aktueller Geräte beträgt daher nur etwa 10%. OaTOF-MS können dieses fundamentale Problem zwar gut dadurch kompensieren, dass der verwendete Detektor einzelne Teilchen detektieren kann, während zum Beispiel bei hochauflösenden Ionenfallen immer mehrere Ionen vorhanden sein müssen, um überhaupt Signale detektieren zu können. Dennoch liegt in der Erhöhung des Duty Cycles Potential für noch höhere Empfindlichkeiten. Dazu muss der Ionenstrom in Pakete gebündelt werden, in denen beim Push Event alle Ionen in das TOF eintreten, während innerhalb der Trennzeit keine Ionen am Pusher ankommen (Abb. 3B). Dies lässt sich bei Einsatz der TWIMS zur Auftrennung der in der ersten Kollisionszelle gebildeten Fragment-Ionen so realisieren, dass ein Duty Cycle von nahezu 100% und damit eine Empfindlichkeitssteigerung von Faktor 10 für den gesamten Massenbereich möglich wird (Abb. 3C).

Das TWIMS-gestützte DDA-Experiment wird mit HD-DDA bezeichnet. Es können bei gleicher MSMS-Messzeit zehnfach höhere Signale beziehungsweise in einem Zehntel der Messzeit gleiche Signalqualitäten im MSMS-Fragmentspektrum erreicht werden. Eine umfassende Darstellung der Leistungsfähigkeit von HD-DDA ist bei Helm et al. [3] zu finden. Abhängig davon, ob bei der TWIMS-Trennung Vorläufer oder Fragment-Ionen getrennt werden, können sowohl die Systemtrennleistung und Spezifität als auch die Empfindlichkeit deutlich erhöht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich durch Einsatz von TWIMS in der Triwave-Zelle des Synapt die Leistung etablierter massenspektrometrischer Methoden entscheidend steigern lässt.

Kontaktadresse:
Dr. Marc Kipping
Waters GmbH
Helfmann-Park 10
65760 Eschborn
Tel.: +49 (0) 6196 400600

marc_kipping[at]waters.com

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