Thema:

Simulation/Modellierung

Realitätsnahe Simulation von Zellsignalprozessen

Die stetig besser werdenden experimentellen zellbiologischen Methoden aus den Bereichen der Proteomik, Genomik oder Mikroskopie bilden die große Komplexität biologischer Prozesse immer genauer ab. Allerdings stellt die optimale Nutzung der gewonnenen Messergebnisse, das heißt die Übersetzung in ein funktionelles Verständnis, große Herausforderungen an die Datenanalyse. Neben klassischen bioinformatischen oder statistischen Analysemethoden wird eine Integration experimenteller Ergebnisse mit quantitativen dynamischen Modellierungsansätzen benötigt. 

Die Erstellung entsprechender Modelle kann jedoch in vielen Fällen technisch so schwierig sein, dass selbst erfahrene Theoretiker auf starke Vereinfachungen bei der Beschreibung der komplexen biologischen Zusammenhänge zurückgreifen müssen. Die hier vorgestellte Modellierungsmethode überwindet viele der technischen Schwierigkeiten und erschließt auch primär experimentell arbeitenden Wissenschaftlern die Möglichkeit, morphologisch und biochemisch realistische Zellmodelle zu simulieren und damit Hypothesen quantitativ zu testen und mit experimentellen Daten abzugleichen.

In den letzten Jahren hat die Anzahl der Forschungsvorhaben sprunghaft zugenommen, die sogenannte Discovery- oder Daten-getriebene Strategien verfolgen und mit neuen Hochdurchsatzverfahren aus der Genomik oder Proteomik primär umfassende Daten generieren. Im Allgemeinen gestatten diese Daten jedoch noch keine unmittelbaren Schlussfolgerungen auf die zugrundeliegenden biologischen Mechanismen, sondern bilden lediglich die Grundlage für das Aufstellen von Hypothesen, die dann in zielgerichteten Experimenten getestet werden müssen.

Viele Phänomene in der Biologie und Medizin entstehen durch ein komplexes Zusammenspiel zahlreicher molekularer Komponenten, die in biochemischen Netzwerken organisiert sind. Die Formulierung zellbiologischer und medizinischer Hypothesen wird durch diese Komplexität erschwert, da solche Gefüge nur noch schwer intuitiv zu erfassen sind, insbesondere, wenn die Hypothesen darauf abzielen, das dynamische Verhalten solcher Vielkomponenten-Systeme zu verstehen oder gar vorherzusagen.

Die Schwierigkeit rührt vor allem daher, dass biologische Prozesse wie etwa die Entwicklung der Immunantwort auf eine Infektion oft nichtlinear sind. Das bedeutet, dass man ihnen nicht unmittelbar ansieht, wie sich Unterschiede in den Ausgangsbedingungen im Laufe der Zeit auf das Verhalten des Systems auswirken können. 

Um dieser Problematik zu begegnen, werden mathematische Modelle und Computerprogramme entwickelt, mit deren Hilfe das zeitlich-dynamische Verhalten biologischer Systeme simuliert werden kann1. Solche theoretischen Ansätze können dem Biologen im Prinzip ein Werkzeug zur Verfügung stellen, mit dem Hypothesen getestet werden können, bevor Experimente gemacht werden oder mit dem geprüft werden kann, ob experimentelle Ergebnisse mit bestehenden Modellen vereinbar sind. In der Zellbiologie ist das Ziel hierbei häufig, mit Hilfe der Simulationen zu untersuchen, ob eine Hypothese prinzipiell ein zelluläres Phänomen erklären kann (kommt die Simulation mit einigermaßen vernünftigen Annahmen dem experimentell beobachteten Sachverhalt wenigstens nahe) und welches Experiment am besten geeignet wäre, die Hypothese detaillierter zu prüfen. 

Simulationen oft zu wenig realitätsnah

Ein Problem solcher Simulationsmodelle war aber bisher zum einen eine vereinfachte – und damit teilweise realitätsferne – Darstellung der komplexen intrazellulären Signalprozesse. Zum anderen war die bei der Modellimplementierung technisch sehr aufwendige Erstellung der mathematischen Gleichungen schwierig. Dies ist besonders gravierend, weil es für solche Anwendungen von Computersimulationen in der biomedizinischen Forschung wesentlich ist, dass ein enger Zusammenhang zwischen dem echten und dem simulierten System (Modell) besteht. Sind die Abstraktionen zu stark, können die Simulationsergebnisse kaum noch mit den experimentellen Daten verglichen werden. Dies birgt zweierlei Gefahren in sich: Es kann sein, dass ein Modell versagt, ohne dass sich die Schwächen des Modelles biologisch analysieren lassen. Dann hat man aus dem Modell nichts lernen können. Zum anderen kann es passieren, dass ein abstraktes Modell gar nicht mehr falsifizierbar ist: Aufgrund der Abstraktion passt es zu einer zu weiten Klasse experimenteller Befunde. Modelle, die nicht falsifizierbar sind, sind wissenschaftlich jedoch nahezu wertlos.

Viele Modelle in der mathematischen und auch der computergestützten Biologie sind sehr abstrakt und rechtfertigen dies oft mit dem Hinweis darauf, dass detailliertere Modelle auch detaillierte Daten benötigen, die nicht immer zur Verfügung stehen. Leider führt diese Argumentation in einen Teufelskreis: Experimentatoren messen weniger Details als sie technisch könnten, weil keine Modelle gebaut werden, die diese Details verwenden würden und umgekehrt. 

Besonders wichtig für das Testen von Hypothesen ist es auch, Modellveränderungen vornehmen zu können: Dabei liegt gerade in der Einführung von Mutationen oder der in silico (also simulierten) Applikation zielgerichteter Inhibition einzelner Signalkomponenten der große Nutzen der Simulationsmodelle. Eine von uns in der Märzausgabe von Nature Methods vorgestellte Methode2 ermöglicht jetzt erstmals eine Kombination aus morphologisch und biochemisch realistischen Zellmodellen – mit einfacher Modellimplementierung und -Simulation und der Möglichkeit, Modelle ohne technische Hürden überwinden zu müssen, an neue Fragestellungen anzupassen. Eine grafische Benutzeroberfläche erleichtert dabei wesentlich die Modelldefinition und Simulation: 

I Zuerst wird das Signalnetzwerk definiert. Vorteil der neuen Methode ist dabei, dass sie eine effiziente Erstellung auch hochkomplexer Netzwerke erlaubt, da lediglich die Moleküle und die relevanten bi-molekularen Interaktionen manuell definiert werden müssen (Abb. 1). Die Konstruktion sämtlicher möglicher molekularer Komplexe und die Erstellung des eigentlichen Signalnetzwerkes (definiert durch die Gesamtheit der Reaktionen zwischen den Komplexen) erfolgt im Anschluss vollautomatisch. Dies ist einerseits wichtig, weil die Anzahl der möglichen multi-molekularen Komplexe die Zahl der einzelnen Signalmoleküle in der Regel um ein Vielfaches übersteigt und damit deren manuelle Definition von einer gewissen Netzwerkgröße an unpraktikabel und fehleranfällig wird.

Des Weiteren wären manuelle Änderungen großer bestehender Signalnetzwerke sehr aufwendig, selbst dann wenn beispielsweise nur das Bindungsverhalten eines einzelnen Proteins verändert werden soll. Denn die Reaktionen für alle Komplexe, in denen das Protein enthalten ist, müssten dann ebenfalls modifiziert werden. Dies bedeutet, dass die automatische Netzwerkgenerierung insbesondere für die computergestützte Erforschung pathologischer Signalpfadveränderungen von Bedeutung ist, da hierfür ausgehend vom physiologischen (gesunden) Ursprungsnetzwerk einzelne oder mehrere Veränderungen in das Modell eingebaut werden müssen.

Um etwa den Effekt einer für die Tumormedizin relevanten Kombinationstherapie eines EGFR-Inhibitors mit einem weiteren zielgerichteten Medikament in Zellen mit einer aktivierenden EGF-Rezeptor-Mutation (und ggf. weiteren Mutationen) zu untersuchen, müssen sämtliche beteiligten Komplexe und mathematischen Reaktionsgleichungen angepasst werden. Mit der automatischen Netzwerkgenerierung erfordert dies lediglich eine manuelle Veränderung pro Molekül (anstatt für alle multi-molekularen Komplexe) mithilfe der grafischen Benutzeroberfläche. Diese Methode erlaubt es daher auch biomedizinischen Wissenschaftlern ohne größere Vorkenntnisse in mathematischer oder computergestützter Modellierung, detaillierte Modelle zellulärer Signalprozesse zu erstellen und so zum Beispiel die Effekte von Mutationen in in silico-Experimenten zu untersuchen.

II Nachdem die Signalkomponenten und ihre gegenseitigen Wechselwirkungen bestimmt sind, wird die Form der Zelle(n), also das morphologische Zellmodell für die Simulationen definiert. Wiederum steht hierfür ein Werkzeug mit grafischer Benutzeroberfläche zur Verfügung. Mit dem ‚Celldesigner’ (Abb. 2) können nahezu beliebige Zellgeometrien erzeugt werden, so dass ein direkter Vergleich der experimentellen Mikroskopiedaten mit den Ergebnissen der Simulationen möglich wird. Ein großer Vorteil der automatisierten Erzeugung von Signalnetzwerken in der neuen Software ist, dass sich die simulierte Biochemie an sich verändernde zelluläre Formen anpassen kann, ohne dass der Benutzer in den Simulationsablauf eingreifen muss. Das bedeutet, die vorgestellte Methode gestattet es erstmals, realitätsgetreue und dynamische Zellformen mit detaillierter Biochemie in Simulationen zu kombinieren.

Des Weiteren ermöglicht die Software eine detaillierte Zuordnung der Signalmoleküle zu verschiedenen (teils durch Diffusionsprozesse kommunizierenden) Zellkompartimenten (membrangebunden oder zytosolisch). Diese Möglichkeit, Rezeptoren spezifischen Membranelementen zuzuweisen und ergänzend zu zytosolischen Molekülen zu betrachten, verbessert die Realitätstreue und damit den praktischen Nutzen der Simulationen.

III  Schließlich wird die eigentliche Simulation des Modells durchgeführt. Die Simulationsergebnisse können in Echtzeit über eine grafische Benutzeroberfläche visualisiert werden, die die präzise Darstellung der Konzentrationen auswählbarer Signalmoleküle im Zeitverlauf mit Bezug zur Zellform (Abb. 3) erlaubt.

Anwendung

Eines der zellulären Signalsysteme, die mit der neuen Methode detailliert untersucht wurden, ist das Reaktionsnetzwerk, das die lokalisierte Stimulation eines Pheromonrezeptors in Hefezellen mit der Aktivierung eines wichtigen Enzyms verbindet, der MAP-Kinase Fus3. Um solche Signale auszutauschen, nehmen die Hefezellen eine charakteristische birnenartige Form an und nähern sich einander an der verjüngten Halsregion, in der dann die Pheromonrezeptoren stimuliert werden.

Die Konzentration der Komponenten des Signalnetzwerks in dieser Region führt zu einer sehr effizienten Fus3-Aktivierung, deren Biochemie in einer beispielhaften Studie umfassend quantitativ untersucht wurde3. Die gemessenen Konzentrationen und molekularen Wechselwirkungsparameter ermöglichten es, ein detailliertes Modell des Netzwerks zu bauen, das dann in eine realistische computergenerierte Zellform eingebettet wurde. Obwohl das modellierte Netzwerk nur ein Dutzend Molekültypen enthält, führt die Tatsache, dass einige von ihnen an mehrere Reaktionspartner gleichzeitig binden und auch in verschiedenen Aktivierungszuständen vorliegen können, zu einer Vielzahl von Komplexkombinationen, deren Reaktionen als ein mathematisches System von mehr als 200 gekoppelten Differentialgleichungen beschrieben werden müssen.

Dazu kommt, dass unterschiedliche Bereiche der simulierten Zellen unterschiedliche Reaktionsnetzwerke beinhalten. Während herkömmliche Simulationsmethoden, bei denen jede einzelne Reaktion vom Modellierer spezifiziert werden muss, hier nicht anwendbar gewesen wären, war die neue automatisierte Methode in der Lage, die experimentellen Befunde nicht nur nachzuvollziehen, sondern darüber hinaus zu zeigen, wie wichtig die räumliche Organisation der Signalkomponenten für die effiziente Aktivierung des Fus3-Enzyms ist.

Die hier beschriebene Software ist frei verfügbar, funktioniert auf Windows-, Macintosh- und Linux-Computern und kann über die Internetseite der Arbeitsgruppe für computergestützte Zellbiologie am Institut für Allergien und Infektionskrankheiten an den NIH (USA) direkt bezogen werden: http://go.usa.gov/QeH


Literatur

[1] Aldridge, B. B., J. M. Burke, et al. (2006). „Physicochemical modelling of cell signalling pathways.“ Nat Cell Biol 8(11): 1195-1203.

[2] Angermann, B. R., F. Klauschen, et al. (2012). „Computational modeling of cellular signaling processes embedded into dynamic spatial contexts.“ Nat Methods 9(3): 283-289.

[3] Maeder, C. I., M. A. Hink, et al. (2007). „Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling.“ Nat Cell Biol 9(11): 1319-1326.

Danksagung

Die beschriebene Forschung wurde gefördert vom intra-muralen Forschungsprogramm des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH), USA.

Korrespondenzadressen

Bastian Angermann1
bastian.angermann[at]nih.gov
Frederick Klauschen1,2
Frederick.Klauschen[at]charite.de
Alex D Garcia1
garciaad[at]mail.nih.gov
Fengkai Zhang1
zhangfen[at]niaid.nih.gov
Martin Meier-Schellersheim
mms[at]niaid.nih.gov

1Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA. 
2Institut für Pathologie, Charité Universitätsmedizin, Berlin

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Heft 2/2012

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