Thema:

Next-Generation Sequencing

Probenvorbereitung auf Liquid Handling-Systemen

Liquid Handling-Systeme sind die Generalisten im Sequenzierungslabor. Ihre Einsatzgebiete reichen vom einfachen Pippetieren, der Probenlogistik über Extraktions- und Aufreinigungsaufgaben bis hin zur Erzeugung von Sequenzierungsbibliotheken im Bereich Next-Generation Sequencing (NGS). Einige Downstream-Anwendungen, wie zum Beispiel Clustererzeugung, Emulsion-PCR bis hin zur direkten Probenvorbereitung vor der Beladung des Sequenzierungsgerätes, werden von dedizierten Automaten durchgeführt. 

Diese Arbeitsteilung im Labor hat im Wesentlichen zwei Gründe: Erstens, der Downstreambereich ist technologisch für die gängigen Laborsysteme zur Zeit wegen des geringen Volumens, der Integration oder Nähe zum Sequenzierungsgerät und der Komplexität noch nicht erreichbar. Zweitens, im Upstreambereich liefern Liquid Handling-Systeme den nötigen Probendurchsatz, insbesondere wenn man die Zunahme von Multiplexverfahren berücksichtigt. Zusätzlich bieten sie sowohl die notwendige Variabilität zur Durchführung vielfältiger Protokolle (Probenvorbereitung für die Sequenzierung von gDNA, RNA, ChIP, Exome Capture, etc.) – unabhängig von der eingesetzten Sequenzierungstechnologie (Illumina, 454, etc.) – als auch die notwendige Anpassungsfähigkeit als Folge der schnellen Evolution der Verfahren. 

Beispielhaft wird hier die Produktion von Bibliotheken aus genomischer DNA (gDNA) beschrieben. Vorausgehen sollen jedoch einige kurze Überlegungen zum Automatisierungsbedarf: Ausgehend von einem Sequenzierungsgerät, zum Beispiel Illumina 2000, ergibt sich eine Kapazität von 16 Lanes. Je nach vorgegebenem Multiplexfaktor von 8 bis 32 ergeben sich zwischen 128 und 768 Bibliotheken, die erzeugt, anschließend vermessen sowie gepoolt werden müssen. Die gleichzeitige manuelle Prozessierung von 48 Proben pro Tag ist eine erhebliche Anforderung an die Gewissenhaftigkeit und Ausdauer des ausführenden Personals. Die Ausführungsdauer skaliert hier linear. 

Ein automatisiertes Liquid-Handling-System wie der Biomek FXp mit SPRIworks HT (Beckman Coulter) benötigt für die vollautomatische Bearbeitung von 1 bis 96 Proben etwa konstant sechs Stunden, kann also entweder mehrmals am Tag gestartet werden oder steht für andere Verfahren zur Verfügung und erlaubt damit dem Laborpersonal die Bearbeitung weiterer Aufgaben. Somit ist die Anwendung eines Liquid Handling-Systems in einer Umgebung bereits mit einem Sequenzierungsgerät überlegenswert.

Automatisiertes Erzeugen von Bibliotheken

Die hier vorgestellte Automatisierungslösung ermöglicht die gesamte Generierung von Bibliotheken ohne jegliche manuelle Eingriffe oder zusätzliche Geräte außerhalb des Decks, ausgehend von der gescherten Ausgangs-DNA bis hin zur größenselektierten und amplifizierten Bibliothek (Abb. 1c). Die Deckkapazitäten sind ausreichend für alle Hilfssysteme, Chemikalien und sonstiges Verbrauchsmaterial. Weitere Module enthalten das Setup für die die Quantifizierung mittels qPCR – andere Verfahren können eingebunden werden –, die Normalisierung und das Pooling.

Das System basiert auf einem Biomek FXp mit einem 96-Kanal-Kopf (bis zu 200 µl) mit integriertem Gripper und einem 8-Kanal-Kopf (bis zu 1.000 µl) mit Kanalspreizung (Abb. 1a). Das Deck ist wie folgt konfiguriert (Abb. 1b): Ein integriertes PCR-Gerät dient sowohl der PCR als auch der sicheren versiegelten Lagerung des Produktes am Ende des Prozesses bei 10°C, ein Peltieradaptor speichert das Restvolumen der Bibliothek, das nicht für die abschließende PCR benötigt wird. Ein Orbitalshaker sorgt für die intensive Vermischung der Reaktanden in den meisten Prozessschritten. Die eingebaute Waschstation erlaubt durch intensives, kanalspezifisches Waschen die mehrfache Verwendung des Spitzenmaterials. Eine Position ist für die Magnetpartikelseparation mit einem Neodymmagneten reserviert.

Reservoire mit entsprechender Konfiguration für Waschen, Reinigung und Größenselektion sowie PCR-Reinigung decken den Bedarf für größere Volumen und benötigen drei weitere Positionen. Enzyme und Puffer werden in Drehverschlussgefäßen in einem Aluminiumblock vorgelegt. Die Waschstation und die flüssigkeitsgetriebenen Pipetten werden mit unterschiedlichen großvolumigen Vorratsflaschen ver- und entsorgt. Vier Positionen werden für sterile und 200 µl-Filterspitzen und eine Position für sterile 1.000 µl-Filterspitzen benötigt. Weitere Positionen werden für Transferplatten im Deepwell- und im PCR-Format, teilweise geschichtet, sowie den selbstdichtenden PCR-Deckel verwendet.

Zwei Positionen sowie das zweite auf dem Deck zu sehende Peltierelement werden hier nicht verwendet. Eingangsproben (50 ng-1 µg in 50 µl) und Adaptoren (2,5 µl, Ilumina. Bei Custom-Adaptoren ist die Konzentration entsprechend ihrer Effizienz anzupassen) werden jeweils in einer Deepwell-Mikrotiterplatte vorgelegt.

Alle Module des Gesamtprozesses sind in einer Softwareoberfläche integriert, können jedoch auch einzeln ausgeführt werden. Die Granularität erlaubt es, die Bibliotheksproduktion selbst an verschiedensten Schritten des Prozesses (Endrepair, A-Tailing, etc.) zu starten. Die Ergebnisdaten aus einer qPCR können automatisiert eingelesen und zur Normalisierung eingesetzt werden. Nach Auswahl der entsprechenden Zielkonzentrationen und der Zuordnung der Ausgangskavitäten zu den entsprechenden Pools erfolgt die Abarbeitung der Arbeitsliste. Das integrierte Fehler„handling“ korrigiert für Proben, die außerhalb der Spezifikation liegen. Die Kalkulation des gesamten Chemikalienverbrauches erfolgt zu Beginn des Prozesses.

Die Bedienungssoftware zeigt sowohl Setup als auch Position der Komponenten und unterstützt den Nutzer zusätzlich. Insgesamt ergibt sich daraus sich eine einfache, flexible und durchgängige Probenlogistik. Die Implementation des Prozesses unter einer integrierten Software stellt jedoch keine Einschränkung für die weitere Verwendbarkeit des Liquid Handling-Systems dar, da das System in allen sonstigen Funktionen und auch der weiteren Programmierbarkeit nicht eingeschränkt ist. In einem Lauf können zwischen 1 und 96 Proben (kontinuierlich in Schritten von 1) prozessiert werden, ohne dass sich die Gesamtausführungsdauer des Programmes wesentlich verändert.

Alle Aufreinigungsschritte und die Größenselektion basieren auf Agencourt Ampure XP- und Agencourt Size Selection-Magnetpartikelen. Es ist möglich, für jede einzelne Probe oder Gruppen von Proben eigene Bereiche für eine Größenselektion softwareseitig festzulegen („small“ [150-350 Bp Peak bei 250 Bp], „medium“ [250-450 Bp, peak bei 350 Bp], „large“ [350-700 Bp, Peak bei 525 Bp]). Die angegeben Werte beziehen sich auf die Fragmentlänge ohne Adaptoren. Entsprechend werden die Verhältnisse von Reaktionsvolumen und Beadvolumen gesteuert. 

Arbeitsablauf

Der Workflow (Abb. 1c) setzt sich im wesentlichen aus den üblichen Schritten der Probenvorbereitung für ein Illumina-System zusammen: Endrepair, A-Tailing, Adapter- Ligation, Größenselektion, PCR, Normalisierung und Pooling. Der Ablauf der einzelnen Schritte besteht aus Zugabe der angesetzten Reaktionsmischungen zur Probe oder zum vorhergehenden Produkt, Mischen auf dem Orbitalschüttler, Inkubation, Zugabe der entsprechenden Magnetpartikel, Inkubation, Separation der Magnetpartikel, Waschen der Magnetpartikel, Elution des Produktes und Überführen des Eluates in eine neue Mikrotiterplatte.

Wegen der fortgesetzten Sedimentation der Magnetpartikel, die sich aufgrund der Dauer des Protokolls auch in einer inhomogenen Verteilung das Materials und damit unvorhersehbarer Ausbeuten und Größenselektion bemerkbar machen würden, wird vor der Zugabe in den Vorratsbehältern durch Pipettieren intensiv gemischt. Da Mikro-titerplatten mehrfach auf dem Deck übereinander gestapelt sind, übernimmt das System auch die entsprechende Plattenlogistik für das jeweilige Stapeln und Entstapeln. Basierend auf dem SPRIworks HT Kit (Beckman Coulter) finden sämtliche Schritte des Prozesses bis auf die integrierte PCR bei Raumtemperatur (15°-30°) statt, bedürfen also in den meisten Fällen keiner zusätzlichen Thermostatisierung. Eine Kompensation der Evaporation oder eine Folierung ist ebenfalls nicht notwendig. Lediglich im Rahmen der PCR wird eine verstärkte Silikonmatte verwendet.

Der Kit enthält alle notwendigen Komponenten bis auf Ethanol, Magnetpartikel zur Aufreinigung der finalen PCR-Produkte sowie den KAPA qPCR-Kit (Kapa Biosystems) zur Quantifizierung der Bibliothek. Die gelieferten Mengen enthalten einen Überschuss der Mengen, die nicht aus den Vorratsgefäßen entnommen werden können.

Die Abbildung 2a zeigt exemplarisch durch Ultraschallscherung (Covaris) erzeugte DNA-Fragmente, die Abbildung 2b die aus einem Aliquot von 100 ng produzierte Bibliothek. Insgesamt sind die Produktmengen sowie Größen nach PCR und Aufreinigung über Platten hinweg homogen. Sie variieren je nach verwendetem Template und Adapter. So lassen sich etwa mit 1 µg Ausgangsmaterial bis zu 1 µg Produkt erzeugen, 100 ng liefern 25 µl mit einer Konzentration von bis zu 3 ng/µl. Die Abbildung 2b zeigt die Größenverteilung der erzeugten Bibliothek bei der gewählten Selektion für „small“, sowie deren Menge. Nach der Aufreinigung sind weder Spuren von Adaptern noch Primern nachzuweisen.

Schachbrettexperimente mit einem Muster aus alternierend belegten und freien Kavitäten, belegen die Abwesenheit von Kreuzkontaminationen. Im Anschluss können die Proben direkt auf einem cBOT-System (Illumina) zur Cluster-Generierung verwendet werden. Auf einem HiSeq2000 (Illumina) lassen sich in der Sequenzierung bis zu 300 GB für 100 Bp, „single End“- und entsprechend 600 GB für „paired End“-Läufe erreichen.


Korrespondenzadresse

Dr. Jürgen Zimmermann
EMBL/GeneCore
Meyerhofstr. 1
D-69117 Heidelberg

genecore[at]embl-heidelberg.de

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