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Genotyping mit ultra-Hochdurchsatz-PCR

Anwendungen der Real-time PCR im Ultrahochdurchsatz stellen wegen der geringen eingesetzten Volumina und großen Geschwindigkeit besonders hohe Ansprüche an die eingesetzte Hardware. Unlängst konnten Forscher der französischen, für den Infektionsschutz zuständigen Behörde ANSES erstmals zeigen, dass das LightCycler® 1536-System (Roche Applied Science, Penzberg) die gefährlichen enterohämorraghischen E. coli (Serovar EHEC O26:H11)-Erreger des hämolytisch-urämischen Syndroms (HUS) anhand einer einzigen Basenvariation im arcA-Gen von harmloseren EPEC-Stämmen unterscheiden kann5. Bislang waren die Tests nur auf wesentlich langsamer arbeitenden PCR-Plattformen möglich, die statt 1.536 lediglich 96 Proben parallel verarbeiten können. 

Forscher des Pariser CRICM2 berichteten kurz darauf über einen neuen PCR-Assay auf dem LightCycler® 1536-System, der die empfindliche Quantifizierung seltenener Tumor-DNA in Blutproben ermöglicht. Mit dem neuen Test, der selten auftretende Mutationen des IDH1-Gens in einem Überschuss frei zirkulierender DNA erfasst, kann der prognostische Marker in Personen mit Hirntumoren (Gliomen) empfindlicher erfasst werden als mit bisherigen Standardverfahren.

Die Detektion erfolgt auf Basis von sequenzabhängigen Änderungen der Schmelztemperatur von IDH1-Allelen und deren direkter Quantifizierung mittels digitaler PCR. In einer dritten Arbeit3 konnten Forscher der Firmen Labcyte und Roche die hohe Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Material- sowie Probenersparnis bei der miniaturisierten qPCR demonstrieren, die sich durch Kombination des Echo 555 Liquid Handlers mit dem LightCycler® 1536-System ergibt. 

Infektionen mit dem Lebensmittelkeim E. coli 026:H11 können schwere Durchfälle hervorrufen oder sogar zum lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom (HUS) führen. Die Schwere des Verlaufs hängt unter anderem vom Erreger ab. Sogenannte EPEC-Stämme rufen meist bei Kindern Diarr­höe hervor. Die gefährlicheren EHEC-Stämme, die blutige Darmentzündungen, Thrombozyto­penie und Nierenfunktionsstörungen verursachen, forderten im vergangenen Sommer im Zuge des bisher schwersten EHEC-Ausbruches in Deutschland 56 Todesopfer.

Mit klassischen mikrobiologisch-biochemischen Tests lassen sich EHEC- und EPEC-Stämme nicht voneinander differenzieren. Genotypisierung der Erregergene wzxO26, flicH11, eae-beta, stx, espK und arcA gestattet jedoch die schnelle und spezifische Bestimmung der meisten Subtypen1. Während sich wzxO26, flicH11, eae-beta, stx und espK mit Hochdurchsatz-qPCR identifizieren lassen, stand für die qPCR-basierte Differenzierung von EHEC und EPEC auf Basis einer Einzelbasenvariation (SNP) im arcA-Gen bislang kein entsprechendes Verfahren zur Verfügung. Wissenschaftler der Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l‘Alimentation, de l‘ Environnement et du Travail (ANSES) um Sabine Delannoy haben unlängst gezeigt, dass die arcA-Genotypisierung auf dem LightCycler® 1536 Real-time PCR-System hochpräzise, schnell und mit hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden kann5.

Mit dem System wurden dazu 148 E. coli-Stämme in Doppelansätzen getestet, deren Haplo­typ durch Sequenzierung bereits bekannt war2. Zusätzlich wurden 33 O26:H11-Stämme unbekannten Genotyps bestimmt. Für die Real-time PCR, die mit der Bravo Liquid Dispenser-Plattform (Agilent) auf ein Endvolumen von 1 µl pro Well eingestellt worden waren, wurden die Primer an DNA-interkalierende Sonden (Minor-groove-binder, MGB) oder alternativ an LNAs (locked nucleic acid) gekoppelt. 

Bei den insgesamt 769 durchgeführten Doppelansätzen zeigten sich keine PCR-Fehler und die Sensitivität war hoch – die mit 0,1-1 ng Template-DNA erzielten Cp-Werte lagen zwischen 19,2 und 27,4 (MGB) beziehungsweise 18,9 und 26.3 (LNA). Zudem beobachteten Delannoy et al. eine große Genauigkeit (vgl. Tab. 1): Die auf dem LightCycler® 1536-System erzielten Genotypisierungsergebnisse mit den 148 Proben bekannter arcA-Sequenz zeigten 100%ige Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Sequenzierung. Zudem ergab sich eine 100%ige Konkordanz der Ergebnisse der Doppelbestimmungen (sowohl bei Nutzung derselben oder einer anderen Mikrowellplatte). Die Analyse war mit weniger als 90 Minuten außerdem schnell. 

Genotypisierung von Biomarkern mit COLD-PCR und digitaler PCR

Mutationen im Gen für das Enzym Isocitrat-Dehydrogenase 1 (IDH1) wurden unlängst mit einer positiven Überlebensprognose von Gliompatienten assoziiert4. Personen mit dem Hirntumor, die eine Punktmutation tragen, zeigen eine höhere Lebenserwartung als solche, die das Wildtypgen tragen. Allerdings ist der bisherige Standardnachweis – die konventionelle PCR mit nachfolgender Sanger-Sequenzierung – nicht sensitiv genug, um die seltene Mutation in einem Überschuss von Wildtyp-DNA zu detektieren. Unter einem Anteil von 20% bezogen auf die Wildtyp-DNA erfasst das Verfahren die Mutation nicht mehr.

Um dieses Problem zu lösen, entwickelten Blandine Boisellier et al. vom CRICM in Paris ein zweistufiges PCR-Verfahren, um frei im Blutplasma flotierende Tumor-DNA mit der IDH1-Mutation selektiv anzureichern5. Bei der Entwicklung ihres hochsensitiven Genotyping-Assays machten sie sich die Tatsache zunutze, dass der Einzelbasenunterschied zwischen IDH1-Wildtyp und -Mutante die Schmelztemperatur verändert und damit die PCR-Effizienz unterhalb einer kritischen Schmelztemperatur Tc drastisch abnimmt. In einer ersten Machbarkeitsstudie auf dem LightCycler® 480-System konnten die Forscher an einer Verdünnungsreihe der DNA mit IDH1-Mutation zeigen, dass der Einsatz der COLD-PCR die Detektion der IDH1-Mutation gegenüber dem Standardverfahren um den Faktor 10 verbessert.

Für den Biomarkernachweis aus Blut wählten Boissellier et al. ein zweistufiges Verfahren. Nach DNA-Extraktion aus Blut reicherten sie zunächst DNA mit der seltenen Mutation selektiv mit COLD-PCR an und quantifizierten die IDH1-Mutation mit Hilfe klonaler Amplifikation in den 1536 wells des LightCycler® Real-time PCR-Systems. Die zuvor selektiv amplifizierte mutante DNA war zuvor 1 zu 100.000 verdünnt worden, so dass statistisch pro Well nur noch 0,5-1 DNA-Moleküle zu erwarten waren und somit eine Quantifizierung (0= nicht vorhanden, 1=vorhanden) der Mutation möglich wird (Digitale PCR). Die Methode ist prinzipiell nicht auf den IDH1-Biomarker beschränkt, sondern lässt sich ganz allgemein zur Biomarker-Anreicherung und -Quantifizierung nutzen.

Miniaturisierte qPCR

Grundsätzlich ist die Miniaturisierung der PCR durch Einsatz des LightCycler® 1536 Real-time PCR-Systems mit einer erheblichen Material-, Proben- und Zeitersparnis verbunden (vgl. Tab. 1). Besonders durch Kopplung an Liquid Handling-Systeme wie den Echo 555 (Labcyte), die kontaktfrei pipettieren, ohne Tips zu benötigen, lassen sich so erhebliche Kosten- und Zeitvorteile erzielen und zugleich Kreuzkontaminationen vermeiden. In systematischen Labortests zeigte das Labcyte-System Standardabweichungen beim Pipettieren zwischen 0,011 µl bei 0,5 µl Endvolumen und 0,025 µl bei 1 µl Endvolumen5. Der kombinierte Einsatz des Echo 555 und des LightCycler® 1536 Real-time PCR-Systems liefert hochreproduzierbare PCR-, Genotypisierungs- und Genexpressions-Ergebnisse.

Fazit

Mit dem LightCycler® 1536 Real-time PCR-System steht ein vollautomatisiertes Hochdurchsatzsystem für verlässliche Genexpressionsanalysen und das Genotyping zur Verfügung.

Literatur

[1] Bugarel M., Beutlin L., Scheutz F., Loukiadis E., Fach P. (2011): Appl. Environ. Microbiol. 77, 2275-2281.

[2] Miko A., Lindstedt B.A., Brandal L.T., Lobersil I., Beutin L. (2010): FEMS Microbiol. Letters 303, 137-146

[3] Dubbink H.J., Taal W, van Marion R, Kros JM, van Heuvel I, Bromberg JE, Zonnenberg BA, Zonnenberg CB, Postma TJ, Gijtenbeek JM, Boogerd W, Groenendijk FH, Smitt PA, Dinjens WN, van den Bent MJ. (2009): Neurology 73(21), 1792-1795

[4] Nobusawa S., Nobusawa S, Watanabe T, Kleihues P, Ohgaki H. (2009): Clin Cancer Res. 15(19): 6002-7

[5] https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/LC1536/index.jsp?id=LC1536_070000

Korrespondenzadresse

Dr. Burkhard Ziebolz
Roche Diagnostics GmbH
Nonnenwald 2
82377 Penzberg

Tel.: +49-(0)8856-604830
Fax: +49 8856-794830
burkhard.ziebolz[at]roche.com
www.roche.com

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