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Automatisierte Diagnostik

Hochdurchsatz-Techniken zur in vitro-Diagnose und Analyse von Blut und Gewebe stehen erstmalig vor einem Systemwechsel. Wurden bislang meist nur wenige Marker untersucht, eröffnen große Fortschritte in den Omics-Techniken zunehmend die Untersuchung von multiplen Parametern in immer größerem Umfang. 

Alexander Kohlmann

LABORWELT:

Welche Fortschritte lässt die zunehmende Automation des NGS in der onkologischen Diagnostik erwarten, und wie verlässlich sind die mit den derzeit vermarkteten Plattformen erzielten Sequenzierungsergebnisse?

Kohlmann:

Seit Juni 2010 sind im MLL Münchner Leukämie Labor (www.mll.com) molekulare Mutationsanalysen auf einer Next-Generation Sequencing-Plattform für Routineanalysen akkreditiert. Dank zunehmender Automation wurde es möglich, einen Großteil der klassischen Sequenzierungsanalysen mittlerweile auf der Roche/454-Plattform durchzuführen. Da die Anzahl an molekularen Markern und Anfragen nach Mutationsanalysen stetig zunehmen, werden neue Gene überwiegend nur noch auf einer Next-Generation Sequencing-Plattform etabliert. Wie kürzlich in einer internationalen Ringstudie gezeigt, zeichnet sich die 454-Technologie durch eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus (Kohlmann et al., Leukemia. 25(12):1840-8.).

Eine breitere Anwendung in der klinischen Diagnostik wird immer deutlicher. So wurden sowohl bei der Probenvorbereitung als auch bei der Bioinformatik große Schritte genommen. Auf der Seite der Probenvorbereitung ist es mittlerweile möglich, bereits vorpipettierte 96-Well-Primerplatten zu verwenden, was die Komplexität im Laboralltag deutlich reduziert. Halbautomatische Miniaturansätze der Amplicon-PCR mittels Access Arrays (Fluidigm) gestatten zudem eine deutliche Reduktion von einzusetzenden Patientenproben und Enzymen.

Verschiedene Automationslösungen erlauben außerdem die vollautomatische Durchführung von PCR-Aufreinigung, Amplicon-Pooling und Bead-Anreicherung für die Sequenzierung (Beckman Coulter). Das Einsatzgebiet der sensitiven Mutationsanalysen stellt sich dadurch gegenwärtig sehr vielfältig dar. Zum einen werden mittels Deep sequencing (~500 einzelne reads pro Amplikon bei Diagnosestellung) ca. 15 molekulare Marker in der Routinediagnostik angeboten, um hämatologische Erkrankungen zu klassifizieren. Weitere Gene eignen sich zudem, um prognostische Einschätzungen eines Krankheitsverlaufs abzugeben.

Verstärkt werden Deep sequencing-Analysen auch genutzt, um die nachgewiesenen patientenspezifischen Mutationen im Anschluss an die Erstdiagnose gezielt im Krankheitsverlauf unter Therapie oder auch vor und nach Transplantation mit sehr hoher Sensitivität zu analysieren (>1000-fold coverage). Jedoch ist bereits abzusehen, dass es in Kürze nicht mehr ausreichend sein wird, einzelne Biomarker zu messen. Stattdessen rücken Gen-Panels immer mehr in den Vordergrund, was die heute kommerziell verfügbaren Plattformen und Automatisierungslösungen vor neue Herausforderungen stellt. 
        

Dr. Alexander Kohlmann Abteilungsleiter Next-Generation Sequencing und Microarrays am MLL Münchener Leukämie Labor. 
alexander.kohlmann@mll-online.com

Stefan Müllner

LABORWELT:

Welche Rolle spielen High-Throughput-Tools zur Biomarker-Analyse in der Diagnostik? 

Müllner:

Der Bedarf an besseren und maßgeschneiderten Wirkstoffen für gezieltere Therapien, insbesondere für chronische Erkrankungen und Krebs, erfordert neue Diagnose-Systeme und indikationsspezifische Biomarker. Die für die Biomarkersuche bislang eingesetzten Omics-Technologien generieren zwar hohe Datendichten, berücksichtigen allerdings in der Regel nicht die elementaren Anforderungen statistischer Verfahren. Für eine sichere Auswahl und Validierung von Biomarkern ist der Variationskoeffizient (VK) entscheidend. Somit eignen sich für die Entwicklung neuer Biomarker nur solche Hochdurchsatztechnologien, die für die Einzelmessung einen VK im einstelligen Prozentbereich ermöglichen. Dies wird umso wichtiger, wenn mehrere Biomarker zu einer diagnostischen Gesamtaussage (Multiplex-Assay) herangezogen werden sollen.

Dr. Stefan Müllner ist CEO der Protagen AG in Dortmund.
stefan.muellner[at]protagen.de

Peter Nürnberg

LABORWELT:

Was kann die Next-Generation-Sequenzierung im Bereich der Diagnostik leisten?

Nürnberg:

Klein aber fein wider groß und mächtig: Bei der Entwicklung der neuen Sequenziermethoden ging es zunächst darum, möglichst viele Megabasen und später Gigabasen mit einem Lauf zu generieren, um wissenschaftliche Durchbrüche in der Genomanalyse zu ermöglichen. So lieferte der erste kommerzielle Sequenzierer der neuen Generation 20 Mb pro Lauf (454 GS20). Das entspricht in etwa einem Bakteriengenom.

Heute sind wir bereits bei 600 Gb (HiSeq 2000), ein Äquivalent von bis zu sechs Humangenomen pro Lauf. Manchmal ist weniger jedoch mehr und Gigantismus nicht die Lösung. Das trifft insbesondere auf die diagnostischen Anwendungen des Next-Generation Sequencings (NGS) zu. Hier kommt es auf Schnelligkeit und Verlässlichkeit an. Das bieten die neuen Benchtop-Sequenzierer mehr oder weniger. Ob 454 GS Junior, Ion Torrent PGM oder der MiSeq von Illumina – sie sind von ihrer Kapazität her (noch) nicht geeignet, ganze Humangenome zu sequenzieren, aber sie liefern beachtliche Datenmengen in sehr kurzer Zeit, wenige Stunden im Vergleich zu vielen Tagen bei ihren großen „Brüdern“.

Damit stellen sie ideale Werkzeuge für die schnelle Sequenzierung von Infektionskeimen oder „Gene Panels“ in einem diagnostischen Umfeld dar. Die einfachere Bedienung und standardisierte Workflows tun ein Übriges. Es ist nur eine Frage der Zeit, wann diese anwenderfreundlichen Tischgeräte Datenmengen in der Größenordnung von kompletten Exomen oder ganzer Humangenome ausspucken (entsprechende Ankündigungen zum Ion Proton von Life Technologies gibt es bereits), aber viele Nutzer werden weiterhin überschaubare Datensätze von gezielten Analysen eines Teilbereiches des Genoms bevorzugen – nicht zuletzt, weil sie mit mehr in mehrfacher Hinsicht überfordert wären. Die Datenhaltung und die Dateninterpretation von ganzen Genomen stellt heute noch zu hohe logistische Anforderungen an die diagnostisch orientierten Nutzer.

Prof. Dr. Peter Nürnberg ist der Geschäftsführer der Berliner ATLAS Biolabs GmbH.
nuernberg[at]atlas-biolabs.com

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Heft 2/2012

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