Thema:

RNA-Sequenzierung

NGS Libraries – leicht und schnell hergestellt

Das Next Generation Sequencing (NGS) ist wenige Jahre nach seiner Entwicklung nicht mehr aus dem modernen Laboralltag wegzudenken. Eine Vielzahl an Fragestellungen kann erst durch NGS verwirklicht werden, da die bisherigen Ansätze entweder zu teuer, zu langwierig oder schlichtweg nicht machbar waren. Hierzu zählen zum Beispiel das Whole Genome Sequencing, das Exome Sequencing, ChIP-Seq und auch die RNA-Sequenzierung. Bei Letzterer wird entweder die messenger RNA (mRNA) spezifisch angereichert oder es werden unerwünschte, häufig vorkommende RNA abgereichert (ribosome-depleted total RNA). Die RNA-Sequenzierung ermöglicht das Auffinden bislang unbekannter Transkripte sowie die Quantifizierung bekannter Transkripte und ist heute ein unverzichtbares Werkzeug, nicht nur in der Grundlagenforschung.

Bevor eine Probe auf einem NGS-System sequenziert werden kann, muss sie in eine sogenannte Bibliothek oder „Library“ umgewandelt werden. Hierzu werden die Ausgangsnukleinsäuren zunächst fragmentiert, um sie den Leselängen des zu verwendenden Sequenziergerätes anzupassen. Danach müssen die Enden repariert, mit einem Überhang (meistens Einzel-A) versehen, Adapter ligiert und angereichert werden.
Gerade die RNA-Sequenzierung bedarf einer meist extrem zeitraubenden Probenvorbereitung – eine Tatsache, die im Zusammenspiel mit hohen Kosten für Reagenzien, teilweise seltenen und kostbaren Proben die Nachfrage nach Automation fördert – auch, um durch zuverlässigere Ergebnisse Kosten zu sparen. Die hohe Anzahl manueller Einzelschritte, die kleinen Volumina und die häufigen Aufreinigungen der Zwischenprodukte mit Hilfe von Magnetpartikeln bedeuten hier nicht nur einen hohen Aufwand, sondern bergen auch die Gefahr vieler Fehlerquellen, die durch Automatisierung minimiert werden können.Für die RNA-Sequenzierung mit Illumina HiSeq- oder MiSeq-Systemen bietet Eppendorf durch speziell programmierte Methoden für die Eppendorf epMotion 5075 eine maßgeschneiderte Lösung, um das Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library-Konstruktionsprotokoll zu automatisieren.


Automatisiertes Liquid Handling

Die epMotion 5075 ist ein automatisiertes Liquid Handling-System, welches mit einer Vielzahl an Werkzeugen und Zubehörmodulen – wie zum Beispiel Ein- und Achtkanal-Pipettierwerkzeugen sowie Heiz-/Kühl- und Mischmodulen – ausgestattet werden kann, um die unterschiedlichsten Protokolle abzuarbeiten. Durch Eppendorfs langjährige Erfahrung, speziell in den Bereichen Liquid Handling, Mischen und Temperieren, liefert die epMotion außerordentlich gute und präzise Arbeitsergebnisse. Dies wird im Zusammenspiel mit Eppendorf-Verbrauchsmaterialien wie Automatenspitzen und PCR-Platten noch weiter unterstützt. Für zusätzliche Sicherheit beziehungsweise Zuverlässigkeit sorgt ein in die epMotion integrierter optischer Sensor, mit dem vor dem Start einer Methode einerseits Füllvolumina innerhalb von Gefäßen und andererseits die korrekte Positionierung von Labware, Spitzen und auch die Bestückung von Spitzenboxen überprüft werden kann.

Speziell für die beschriebene Methode ist die epMotion 5075 mit einem ThermoMixer-Modul und einem weiteren Temperaturmodul ausgestattet, um die unterschiedlichen, aufeinander folgenden Inkubationsschritte abarbeiten zu können. Die gesamte Prozedur zur automatisierten Herstellung sequenzierfertiger Libraries ist auf drei Untermethoden verteilt, die von der epMotion – bis zur Anreicherungs-PCR – unterbrechungsfrei abgearbeitet werden. Um ein möglichst hohes Maß an Automation zu erreichen, ist die Methode für 8, 16 oder 24 Proben konzipiert, alle Inkubationsschritte – bis auf die Anreicherungs-PCR – werden in den auf der epMotion verfügbaren Temperaturmodulen durchgeführt. Die Untermethoden enden jeweils an den von Illumina im Protokoll angegebenen „Safe Stopping Points“, die es erlauben, die Zwischenprodukte für bis zu sieben Tage bei -20 °C bis -15 °C zu lagern. Die Gesamtlaufzeiten zur Herstellung von 8/16 oder 24 Libraries betragen 9,5; 10,5 und 11,5 Stunden – darin eingerechnet sind schon 45 Minuten Anreicherungs-PCR auf einem externen PCR Cycler – wie zum Beispiel dem Eppendorf Mastercycler Pro S. Dies ist für zum Beispiel acht Proben nicht unbedingt schneller als eine manuelle Präparation, aber dafür kann die Walk-away-Zeit genutzt werden, um andere Aufgaben zu erledigen. Außerdem ist die automatisierte Prozedur reproduzierbarer und vollständig dokumentiert. Alle Reaktionsschritte erfolgen in Eppendorf 96-well twin.tec semi-skirted-PCR-Platten – zur effizienten Reduktion der Vorbereitungszeit und Totvolumina werden die im Illumina-Kit vorhandenen Reagenzien in 1,5- oder 2,0 mL-Eppendorf SafeLock Tubes vorgelegt und durch Einkanal-Pipettierwerkzeuge zu den Proben pipettiert. Lediglich die für die Zwischenaufreinigungen notwendigen Magnetpartikel (Agencourt, AMPure XP und RNAclean XP Beads, Beckman Coulter) und die Waschlösungen (70 % bzw. 80 % Ethanol) werden zur Verteilung mit einem Achtkanal-Pipettierwerkzeug in Reservoire vorgelegt. Die für die Sequenzierung und das Pooling notwendigen Index-Adapter können auf einer Arbeitsposition in unterschiedlicher Labware vorgelegt werden – je nach Anzahl, Kombination und Volumen. Hierzu kann die entsprechende vorgefertigte Methode vor dem Start einfach in der epBlue-Software des Gerätes angepasst werden. Ebenso ließen sich noch zusätzliche Schritte integrieren, bei denen die finalen Libraries in benutzerdefinierte Zielgefäße transferiert werden könnten.

Die gesamte Vorbereitungszeit für einen kompletten Lauf mit 24 Proben beträgt weniger als eine Stunde, was eine deutliche Zeitersparnis gegenüber einem manuellen Abarbeiten der Prozedur bedeutet – hierfür wären etwa drei ganze Labortage mit jeweils acht Proben erforderlich.
Typische Ergebnisse für 100 oder 1000 ng eingesetzte Gesamt-RNA (Agilent UHR) sind in der Abbildung 1 gezeigt. Mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer und dem DNA 1000-Kit wurden Fragmentgrößen zwischen 180 und 600 bp nachgewiesen – mit einem Maximum bei ca. 270 bp. Die mit dem Qubit dsDNA HS Assay (Life Technologies) ermittelten Library-Ausbeuten liegen bei bis zu 24,9 ng/µL für 100 ng eingesetzte Gesamt-RNA bzw. 37,7 ng/µL für 1000 ng Gesamt-RNA. Das nutzbare finale Elutionsvolumen betrug 17,5 µL. Zur Sequenzierung wurden jeweils sechs Libraries gepoolt und in einer Lane einer HiSeq Flowcell im Paired End-Modus sequenziert (2x101 nt + 7 nt Index Adapter). Typische Sequenzierergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Durchschnittlich wurden mehr als 30 Millionen Readpaare pro Probe erreicht, davon ließen sich 88,53 % alignieren, die Strang­information war in 99,23 % der Reads korrekt, und nur 0,21 % bzw. 0,18 % der Reads waren ribosomalen bzw. mitochondrialen Ursprungs. Adapterdimere waren so gut wie nicht vorhanden.

Fazit

Beschrieben ist eine maßgeschneiderte Automationslösung, mit der sich mit äußerst wenig manuellem Aufwand aus 8, 16 oder 24 Proben von jeweils 100 bis 1000 ng Gesamt-RNA in insgesamt 12 Stunden reproduzierbare, sequenzierfertige Libraries herstellen lassen. Die Sequenzierdaten und die Qualitätsmetriken der Libraries, die mit der epMotion hergestellt wurden, sind vergleichbar mit denen von manuell hergestellten Libraries. Zusätzliche Methoden zur Bearbeitung weiterer Library Kits von Illumina sind in der Planung – darüber hinaus lässt sich die epMotion natürlich individuell für weitere Liquid-Handling-Aufgaben – auch durch den Anwender – programmieren und nutzen.

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1/2014

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