Gastbeitrag

Automatisierte Probenvorbereitung im Labor
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Dr. Oliver Popp und Dr. Gunnar Dittmar, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin

Automatisierte Probenvorbereitung im Labor

Genetische Information fließt, entsprechend dem von Francis Crick vor 60 Jahren formulierten zentralen Dogma der Molekularbiologie, von DNA, über RNA zu Proteinen. Neben der qualitativen Beschreibung der drei Molekülklassen steigt heute das Interesse an deren Quantifizierung. Moderne Hochdurchsatzverfahren, sogenannte OMICS-Methoden, können die Gesamtheit aller Gene (Genomics), deren Aktivierung (Transcriptomics) und die davon abgeleiteten Proteine (Proteomics) abbilden. Insbesondere die Identifikation und Quantifizierung des Proteoms stellt eine Herausforderung dar, da nicht nur eine große Anzahl von Proteinen identifiziert, sondern auch ein großer dynamischer Bereich abgebildet werden muss und die Kopienzahl der Proteine sehr unterschiedlich sein kann.[1]

Moderne Massenspektrometrie-basierte Proteomik ist dieser Herausforderung gewachsen. Sie beruht auf der Identifikation von Peptiden, die durch einen proteolytischen Schritt aus Proteinen hergestellt werden. Bei diesem sogenannten Bottom-up-Verfahren werden die Peptide auf einem Flüssigchromatographiesystem (LC) aufgetrennt und mittels Elektrospray-Ionisierung aufgeladen, um sie dann mit einem hochauflösenden Massenspektrometer zu identifizieren. Die hier aufgezeichneten Massenspektren werden in einer computerbasierten Analyse-Pipeline analysiert.

Knackpunkt Probenverdau

Ein zuverlässiger und hocheffizienter Probenverdau ist eine Voraussetzung für die tiefe Proteom-Analyse und somit ein essentieller Teil der Probenvorbereitung. In einem typischen Workflow werden Proteine mit der Protease Trypsin verdaut (Abb.: A). Das Enzym spaltet spezifisch C-terminal nach den Aminosäuren Lysin und Arginin und produziert somit Peptide, die sich gut auf einem LC-gekoppelten Massenspektrometer analysieren lassen.

Für einen vollständigen Verdau müssen die Proteine zunächst denaturiert und entfaltet werden, damit die verwendeten Proteasen an allen Teilen des Proteins schneiden können. Proteine aus einem Lysat (gewonnen aus unter anderem Zellen oder Gewebe) werden unter stark denaturierenden Bedingungen (8 M Harnstoff) entfaltet. Anschließend werden die noch vorhandenen Disulfidbrücken mit einem Reduktionsmittel (DTT, TCEP) reduziert und die dabei entstandenen freien Sulfhydrylgruppen mit Chloroacetamid oder Iodoacetamid alkyliert. Dies verhindert die Bildung von neuen Disulfidbindungen während der Messung. Nun kann das Protein in Peptide zerschnitten werden. Da Trypsin in 8 M Harnstoff nicht aktiv ist, wird für diesen Schritt Endopeptidase LysC verwendet, die C-terminal von Lysinen schneidet. Nach erfolgtem ersten Verdau kann die Probe auf 2 M Harnstoff verdünnt werden, eine Harnstoffkonzentration, die Trypsin oder andere Proteasen tolerieren können. Der Verdau erfolgt über mehrere Stunden und wird mit einem Entsalzungsschritt nach Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) abgeschlossen. Die Proben können sodann auf einem LC-MS-Setup gemessen werden. Dieser Workflow kann grundsätzlich für den Verdau von Proteinen in Lösung oder in Abwandlung für die Präparation von Proteinen, die auf einer SDS-PAGE aufgetrennt wurden, angewendet werden.

Die Aufbereitung von Proben im Proteomics-labor ist einer der Engpässe. Um den dafür notwendigen Zeit- und Arbeitsaufwand zu verkürzen, wurden verschiedene Workflows entwickelt, die diese Probenvorbereitungsschritte unter standardisierten Bedingungen vollautomatisiert ausführen können. Die automatisierten Arbeitsabläufe wurden auf PAL-Robotern (CTC; Axel Semrau GmbH) entwickelt. Die Methoden umfassen sowohl den Verdau in Lösung (Abb.: B) [2, 3], als auch den Verdau von Proteinen in Gelbanden (Abb.: C). Die Zugabe der Enzyme, Reagenzien und Waschlösungen erfolgt durch sequentielles Pipettieren, beziehungsweise Absaugen in der Vakuumkammer. Für die Lagerung der Enzyme bis zur Verwendung stehen gekühlte, beziehungsweise beheizte Kammern für die Verdaureaktion zur Verfügung. Dies erlaubt die Bearbeitung von einer bis mehr als 100 Proben gleichzeitig, was die Anwendung sehr flexibel macht. Die Methode ist an den Durchsatz eines Proteomics-Labors angepasst, der durch die Messkapazität des LC-MS-Setups begrenzt ist.

Fazit

In der Massenspektrometrie-Abteilung des Max-Delbrück-Centrums Berlin werden Labor-Arbeitsabläufe automatisiert. Dies führt nebst Zeitersparnis zu hoher Reproduzierbarkeit und mehr Identifikationen im Vergleich zur manuellen Präparation (Abb.: D).


Literatur

[1] Aebersold, R. & Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422, 198–207 (2003).

[2] Kanashova, T. et al. Differential proteomic analysis of mouse macrophages exposed to adsorbate-loaded heavy fuel oil derived combustion particles using an automated sample-preparation workflow. Anal Bioanal Chem (2015).

[3] Tuorto, F. et al. The tRNA methyltransferase Dnmt2 is required for accurate polypeptide synthesis during haematopoiesis. EMBO J. (2015).


Kontakt

Dr. Gunnar Dittmar

Technologieplattform 

Massenspektrometrie

Max-Delbrück-Centrum 

für Molekulare Medizin

Robert-Rössle-Str. 10

13092 Berlin-Buch

Tel.: +49(0) 30 9406 2642

gdittmar[at]mdc-berlin.de


Abbildung:

(A) Ablauf eines enzymatischen Proteinverdaus (B) Schematisches Roboter-Setup für den In-Lösung-Verdau: Die Reagenzien (TCEP, CAA, TFA) werden bei Raumtemperatur bereitgestellt. Waschlösungen zum Reinigen der Spritze nach jedem Transferschritt (Wasser und organisches Lösungsmittel) werden in einer Waschstation vorrätig gehalten. Die Enzyme Endopeptidase LysC und Trypsin befinden sich in einer 96-Well-Platte (8°C) bis sie vom Roboter in die Probenplatte transferiert werden. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur. (C) Schematisches Roboter-Setup für den In-Gel-Verdau: Reagenzien und Enzyme werden wie in B beschrieben  gelagert. Die Gelstücke liegen in einer 96-Well-Platte mit PTFE-Filtermembran. Die Platte steht auf einer Vakuumkammer, die das automatische Absaugen der Waschlösungen ermöglicht. Die PTFE-Membran hält die Lösungsmittel und Reagenzien zurück, bis ein Vakuum angelegt wird. Die Inkubation erfolgt bei Raumtemperatur. (D) Schema des zeitlichen Ablaufs der beiden automatisierten Probenverdaue.

http://www.laborwelt.de/service/extras/automatisierte-probenvorbereitung-im-labor.html

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