Thema:

Gene Editing

Gene gezielt modifizieren mit Designer-Nukleasen

Gene Targeting, also die gezielte Modifikation eines bestimmten Gens in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus, war bislang die Standardmethode zur funktionellen Genomanalyse und um Tiermodelle für die Biomedizin bereitzustellen. Damit wurde die Maus zum meistverwendeten Säugetiermodell – und die Entwickler der Technologie 2007 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Obwohl das Potential dieser Technologie für viele Spezies offensichtlich ist, konnten funktionale ES-Zellen bislang nur für die Spezies Maus, Ratte und Affe etabliert werden. Gene Targeting beim Nutztier kann zwar mittels somatischem Kerntransfer erzielt werden, ist aber technisch aufwendig. Bei beiden Methoden muss die genetische Veränderung über homologe Rekombination in vitro kultivierter Zellen durchgeführt werden. Die verwendeten Zellen müssen die Fähigkeit besitzen, die Entwicklung eines neuen Lebewesens zu unterstützen oder zu tragen. Seit einiger Zeit steht aber eine Alternative zur Verfügung, das Gene Editing.

Mit der Einführung des Gene Editing – so genannt, um es vom Gene Targeting zu differenzieren – wurde unlängst eine technologische Hürde übersprungen, sowohl hinsichtlich der Effizienz, mit der gezielte Veränderungen ins Genom eingebracht werden können, als auch hinsichtlich der Auswahl der Spezies. Die Methode beruht auf dem Einsatz neuartiger sequenzspezifischer Designer-Nukleasen: Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) oder TAL-Effektornukleasen (TALENs). Sie sind in Pflanzen, Reptilien, Fischen und Säugetieren aktiv. Durch die hohe Effektivität kann die Genmanipulation in Zellen, aber auch direkt in der befruchteten Eizelle durchgeführt werden, und das selbst für Säugetierarten, für die es weder funktionale ES-Zellen gibt noch der Kerntransfer eine Option darstellt.

ZFNs und TALENs werden häufig auch als molekulare Scheren oder Designer-Nukleasen bezeichnet, da sie eine Zielsequenz im Genom erkennen und dort einen DNA-Doppelstrangbruch induzieren. Daraus folgt, dass sowohl ZFNs als auch TALENs Elemente zur Sequenzerkennung und Endonuklease-Aktivität besitzen müssen (vgl. Abb. 1A). 

Aufbau von Designer-Nukleasen

Die seit mehreren Jahren bekannten ZFNs beruhen – wie der Name schon impliziert – auf dem Motiv der Zink-Finger, welche ubiquitär in Transkriptionsfaktoren gefunden werden. Ein einzelner Zink-Finger hat eine Größe von 20 bis 30 Aminosäuren und ist strukturell gekennzeichnet durch das Vorhandensein von zwei β-Faltblättern und der als Erkennungshelix bezeichneten α-Helix. Der am häufigsten verwendete Typ von ZFNs besteht aus drei bis vier Zink-Fingern; jeder davon bindet drei aufeinanderfolgende Basen der Zielsequenz. Somit ergibt sich für eine einzelne ZFN eine Erkennungssequenz von 9 bis 12 Basenpaaren, für ein ZFN-Paar von 18 bis 24 Basenpaaren. 

TALENs beruhen auf den Transkriptionsaktivator-ähnlichen (transcription activator-like effector, TAL) Effektoren, welche erstmals als Virulenzfaktoren in Pflanzenpathogenen wie Xanthomonas spp. gefunden wurden. Die DNA-Bindung von TAL-Effektoren wird über eine Domäne mit 12 bis 27 Wiederholungseinheiten von je 33 bis 35 Aminosäuren vermittelt, wobei jede Einheit über zwei hochvariable Aminosäurereste (repeat-variable di-residue, RVD) an genau eine Base der Zielsequenz bindet. Mit einem Aufgebot von nur vier verschiedenen Wiederholungseinheiten ist es somit theoretisch möglich, für jede beliebige DNA-Sequenz einen passenden TAL-Effektor zu entwerfen, welcher je nach Anzahl der Wiederholungseinheiten eine Sequenzspezifität von 12 bis 27 Basenpaaren besitzt, für ein TALEN-Paar somit 24 bis 54 Basenpaare.

Diese hohe Spezifität der DNA-Bindedomänen sollte garantieren, dass nur die Zielsequenz beziehungsweise das Zielgen erkannt wird. Während die Erkennungssequenz eines normalen Restriktionsenzyms sechs Basenpaare umfasst und somit im Durchschnitt alle 4.096 Basenpaare auftritt, sollte eine 18 Bp-Erkennungssequenz einer Designer-Nuklease nur einmal in 69 Milliarden Basenpaare vorhanden sein – zum Vergleich: das menschliche haploide Genom umfasst 3 Milliarden Basenpaare.

Sowohl in TALENs als auch in ZFNs ist die jeweilige DNA-Bindedomäne mit der katalytischen Domäne der Endonuklease FokI fusioniert, welche nach Dimerisierung einen Doppelstrangbruch in der Trennungssequenz zwischen den beiden Erkennungssequenzen induziert. 

TALE- und ZF-Nukleasen werden immer paarweise eingesetzt, mit Erkennungssequenzen für beide DNA-Stränge und mit einem Abstandshalter von etwa 15 Basenpaaren zwischen den Erkennungssequenzen. Dieser Zwischenbereich wird dann von der FokI-Endonuklease gespalten.

Gene Editing in vitro und in vivo 

Wie auch die bereits bekannten Meganukleasen nutzen TALENs und ZFNs aus, dass ein induzierter Doppelstrangbruch zur Aktivierung zellulärer Reparaturmechanismen führt. Zur Reparatur der eingeführten Läsionen stehen zwei gut konservierte Mechanismen zur Auswahl – die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder die Reparatur über eine homologe Vorlage (s. Abb. 1B). 

Genommodifikationen mit Hilfe von Designer-Nukleasen können also zwei Formen annehmen: Ohne Zugabe eines exogenen DNA-Donors findet an der anvisierten Stelle nicht-homologe Endverknüpfung statt. Aufgrund von Ungenauigkeiten bei der Reparatur kommt es dabei zu kleineren Insertionen und Deletionen. Werden die Erkennungssequenzen also in einem der vorderen Exons gewählt, kommt es häufig zu einem Knock-out des Gens. Diese Vorgehensweise bietet die Möglichkeit, Gene auszuschalten, ohne dabei im Genom Spuren in Form von Selektionskassetten zu hinterlassen.

Wird dagegen ein Vektor mit homologen Sequenzen gemeinsam mit den Designer-Nukleasen transfiziert, so können über homologe Rekombination definierte Mutationen oder Transgene am gewünschten Locus eingeführt werden, im Vergleich zum herkömmlichen Gene Targeting allerdings mit deutlich erhöhter Effizienz. 

Für das Einbringen der Designer-Nukleasen in die Zelle stehen grundsätzlich alle bisher bekannten Transfektionsmöglichkeiten zur Verfügung. Besonders interessant ist jedoch die Transfektion als in vitro transkribierte mRNA, da eine transiente Expression für die Induktion des Doppelstrangbruches ausreichend erscheint und gleichzeitig eine zufällige Integration und die damit einhergehende potentielle Schädigung durch Off-Target-Aktivtät vermindert werden kann. 

Die bisherigen Experimente mit Designer-Nukleasen zeigen, dass Gene Editing sehr effizient ist und auch ohne Selektion Mutationsraten von 30% bis 50% auftreten1,2. Selbst biallelische Knock-outs treten mit Frequenzen von 1% bis 20% auf3,4

Das Potential der Designer-Nukleasen soll hier an zwei Beispielen der in vitro- und in vivo-Genmanipulation verdeutlicht werden. Humane ES-Zellen sind mit Hilfe des normalen Gene Targeting nur schwer zu modifizieren. Durch den Einsatz von Designer-Nukleasen kann sich dies jedoch ändern. So konnten mittels eines neuartigen Assemblierungsprotokolls in kürzester Zeit 96 TALENs für verschiedene Ziele in humanen ES-Zellen hergestellt werden, die in 87% der Fälle zu einem erfolgreichen Knock-out führten3.

Noch interessanter für die funktionelle Genanalyse und für die Entwicklung von Tiermodellen ist die Möglichkeit, dass mit Hilfe von ZNFs oder TALENs ein Knock-out und selbst homologe Rekombination direkt im Tier, in der befruchteten Eizelle, durchgeführt werden kann. Dies wurde für Mäuse gezeigt und in eigenen Experimenten für das Kaninchen – einer Spezies, für die weder funktionelle ES-Zellen vorhanden sind noch der somatische Kerntransfer etabliert ist (Abb. 2)4. Designer-Nukleasen eröffnen somit neue Möglichkeiten für die genetische Manipulation von fast allen Zelltypen und in einer Vielzahl von Spezies.

TALENs oder ZNFs?

Im insgesamt noch recht jungen Feld der Designer-Nukleasen stellen die ZFNs die besser charakterisierte Spezies dar. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten ihre Wirksamkeit in einer Vielzahl von Organismen und Zelltypen nachweisen; ebenso wurden mehrere Protokolle erstellt, mit deren Hilfe eigene ZFNs hergestellt werden können. Aber gerade die Assemblierung von funktionalen ZFNs stellt noch ein Hindernis bei der Verbreitung dieser Technologie dar – zwar müssen im Vergleich zu TALENs weniger Einzelmotive zusammengefügt werden, um ein funktionstüchtiges Molekül zu erhalten; dafür gestaltet sich der Designvorgang für funktionale ZFNs als deutlich schwieriger. Dies liegt zum einen daran, dass Zink-Finger Basentripletts erkennen und bisher nicht für alle denkbaren Tripletts wirksame Zink-Finger identifiziert wurden – nur etwa alle 500 Basenpaare findet sich im Genom eine geeignete Sequenz. Zum anderen kommt es zwischen den einzelnen Zink-Finger-Motiven einer ZFN  zu Interaktionen, welche die Bindeeigenschaften erheblich verändern. Eine auf dem Papier ideale ZFN kann also in der Zelle unter Umständen nur sehr schlechte DNA-Affinität zeigen, was ein zeitaufwendiges Funktionsscreening der selbstentworfenen ZFNs unumgänglich macht. Hinzu kommt der Off-Target-Effekt – die Aktivität außerhalb der eigentlichen Zielregion –, der bei ZFNs bei Verwendung der Wildtyp-FokI-Domäne nicht unerheblich ist und zu erhöhter Zytotoxizität führt.

TALENs – obwohl erst seit kurzem bekannt – können dagegen über die verfügbaren Protokolle hergestellt werden, ohne dass Probleme hinsichtlich der Funktionalität auftreten. Das liegt daran, dass nach den bisherigen Erkenntnissen die einzelnen Wiederholungseinheiten einer TALEN in ihrer DNA-Bindung komplett voneinander unabhängig sind und es nicht zu Positionseffekten kommt. Ebenso können TALENs aufgrund des zugrundeliegenden
„Eine-Base-eine-Aminosäure“-Codes für jede beliebige DNA-Sequenz konstruiert werden. Erstaunlich ist zudem, dass alle bisher publizierten TALENs trotz Wildtyp-FokI-Domäne keine Off-Target-Aktivität zeigen.

Beide Arten von Designer-Nukleasen sind gebrauchsfertig erhältlich: TALENs kosten zwischen 3.000 und 5.000 Euro, was auch zu einer Preisreduzierung bei ZFNs führen dürfte (bisher kosten diese zwischen 12-000 und 25.000 Euro für nicht-kommerzielle Anwendungen). Sowohl für ZFNs als auch für TALENs gibt es zudem Kits für 650$ bzw. 350$, mit denen die Nukleasen im heimischen Labor hergestellt werden können; aus den genannten Gründen funktioniert dies jedoch für TALENs sehr viel besser und auch deutlich schneller als für ZFNs.

Fazit

Insbesondere TALENs haben aufgrund ihrer guten Verfügbarkeit und der Robustheit des zugrundeliegenden Codes das Potential, Gene Targeting zu revolutionieren.
Biallelische Knock-outs, die vorher meist nur durch Züchtung erreicht werden konnten, können mit Hilfe von Designer-Nukleasen in einem Schritt realisiert werden. Ebenso ist es möglich, durch gleichzeitige Anwendung verschiedener TALENs oder ZNFs zwei Targets gleichzeitig zu verändern. All dies ist zudem in Spezies möglich, in denen Gene Targeting mit den bisherigen Methoden nicht oder nur schwer durchführbar war, einschließlich Pflanzen und Reptilien. Designer-Nukleasen sind ein effizientes, zeitsparendes Werkzeug für die funktionelle Genanalyse und bieten Möglichkeiten für die Herstellung komplexer Krankheitsmodelle zur besseren Erforschung von Humanerkrankungen in physiologisch relevanten Tierspezies. Große Chancen bieten sich auch in der personalisierten Medizin: Die große Effektivität von TALENs, ihre geringe Off-Target-Aktivität und die Tatsache, dass nach der Genkorrektur keine fremden Sequenzen im Genom zurückbleiben, machen sie zu idealen Werkzeugen für die Gentherapie. 

Literatur

1. Hockemeyer, D. et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology 29 (2011), 731-734.
2. Li, T. et al. Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic acids research 39 (2011), 6315-25.
3. Hauschild, J. et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 12013-12018 (2011).
4. Santiago, Y. et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105 (2008), 5809-14.
5. Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nature biotechnology 30 (2012), 460-5.
6. Flisikowska, T. et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PloS one 6 (2011), e21045.

Korrespondenzadresse

Dr. Tatiana Flisikowska
TU München
Lehrstuhl für Biotechnologie der Nutztiere
Liesel-Beckmann-Str. 1
85354 Freising
Tel.: +49-(0)8161-712030
tatiana.adamowicz[at]wzw.tum.de

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